深海熱液噴口微生物群落研究進(jìn)展

魏曼曼, 陳新華, 周洪波

(1. 中南大學(xué) 資源加工與生物工程學(xué)院, 湖南 長沙 410083; 2. 國家海洋局 第三海洋研究所 海洋生物遺傳資源重點實驗室, 361005)

深海熱液噴口微生物群落研究進(jìn)展

Research process of microbial community in deep-sea hydrothermal vents

魏曼曼1, 陳新華2, 周洪波1

(1. 中南大學(xué) 資源加工與生物工程學(xué)院, 湖南 長沙 410083; 2. 國家海洋局 第三海洋研究所 海洋生物遺傳資源重點實驗室, 361005)

1977年在太平洋上的加拉帕戈斯群島附近深2 500 m的深海熱液區(qū)首次發(fā)現(xiàn)了獨立的生命體系,它被認(rèn)為是海洋生物學(xué)研究領(lǐng)域中最為重大的發(fā)現(xiàn)之一[1-2]。自此, 對深海熱液噴口生物群落的調(diào)查研究吸引了無數(shù)科學(xué)家的眼球, 成為了海洋生物學(xué)研究領(lǐng)域的熱點之一。30余年來, 隨著海洋生物學(xué)研究技術(shù)方法的進(jìn)步, 大量的深海熱液噴口生物群落被相繼發(fā)現(xiàn), 越來越多的噴口生物物種被分離鑒定出來[3-4], 從而改變了人們對深海熱液環(huán)境的認(rèn)識,極大的拓展了人們的海洋生物學(xué)知識。

深海熱液噴口是一種黑暗、低氧、高壓、低營養(yǎng)以及富含硫化物的極端環(huán)境。這里幾乎沒有陽光,且表層海洋生物光合作用產(chǎn)生的有機(jī)碳只有極少量能夠到達(dá)深海, 因此形成了一類不依賴光合作用而是以微生物的化學(xué)合成為基礎(chǔ)的獨特生態(tài)系統(tǒng)[5]。通常熱液噴口規(guī)模較小, 中心溫度極高(有時會高達(dá)350℃), 外圍水體溫度較低(一般＜2℃), 溫度差異比較大, 例如在噴口周圍水溫 20℃處向外不到 1 m的距離, 水溫便可降為 2℃。因此, 獨特的生態(tài)環(huán)境使深海熱液噴口周圍的生物群落無論是在代謝上,生理上和分類上都極具多樣性[6]。其中又以微生物的種類最為豐富, 作用最為重要。另外, 急劇變化的溫度, pH及化學(xué)梯度賦予了深海熱液微生物獨特的生理生化特征, 這些獨特微生物資源的開發(fā)利用對于現(xiàn)有菌種資源的補(bǔ)充和改善具有重要意義。

1 深海熱液噴口環(huán)境

1.1 深海熱液噴口環(huán)境的形成

目前, 在太平洋, 大西洋和印度洋水深800 m到3500 m的區(qū)域中已發(fā)現(xiàn)了 200多處熱液噴口區(qū)[7]

(圖 1), 它們主要出現(xiàn)在地殼運(yùn)動活躍的海洋區(qū)域[8],如大洋中脊, 弧后盆地和板內(nèi)火山, 其形成是地球板塊構(gòu)造的產(chǎn)物。大多數(shù)的海洋板塊被海洋中脊所分隔開來, 這些洋中脊可深達(dá)60 000 km。這些板塊相互分離卻又緊密相連。因此, 冰冷的海水就可沿著洋中脊系統(tǒng)的地殼裂縫向下滲透。在滲透過程中, 海水被逐漸加熱, 于是就產(chǎn)生了海水在地殼裂縫中的對流循環(huán)。在經(jīng)過復(fù)雜的循環(huán)之后, 熱液流就會向上噴射, 與氧化性的低溫海水相遇。這些熱液流偏酸性,具還原性且富含重金屬(包括鐵, 錳, 鋅, 銅等)及無機(jī)分子(如H2, CH4, H2S, CO2, CO)。如果在噴射出來之前熱液流就與冷海水混合, 它們的溫度就會急劇下降(約為10～40℃)。這里就成了無脊椎動物的繁盛之所。如果噴射之前沒有與冷海水混合, 熱液流的溫度就會高達(dá)350℃甚至更高。當(dāng)它們噴射而出時, 溶解于其中的礦物質(zhì)元素與冷海水接觸, 就不斷有金屬硫化物沉淀形成。這些沉積物沉積在海底, 形成熱液硫化物礦床, 有時會形成高達(dá)10～15 m的海底“黑煙囪”。在海水沿著洋中脊系統(tǒng)的地殼裂縫循環(huán)流動的過程中, 地?zé)崮鼙晦D(zhuǎn)化為化學(xué)能, 儲存在還原性的無機(jī)化合物中。這些化合物是由海水與高溫的裂縫巖石反應(yīng)而形成的, 通常由2000 m到3000 m水深的海底噴口(25～350℃)噴涌而出, 從而為噴口生物群落的繁殖提供了基本的物質(zhì)條件。

圖1 全球主要熱液噴口區(qū)域的分布圖[7]

1.2 深海熱液噴口微生物的能量來源

在熱液噴口發(fā)現(xiàn)之前, 只有化能自養(yǎng)型的硫氧化菌是海底的已知生物, 但是如此重要的生產(chǎn)者在當(dāng)時并不被認(rèn)為對海洋生態(tài)系統(tǒng)有什么特別的意義[5]。熱液噴口發(fā)現(xiàn)不久, 硫化氫的生物氧化被推測為其能量來源[8]。隨后, 大量實驗表明, 噴口周圍化學(xué)合成活動極其頻繁, 因此, 普遍認(rèn)為噴口生物生存所需的有機(jī)碳源來源于化能合成細(xì)菌?；軣o機(jī)營養(yǎng)菌可通過噴口硫化物熱液中的H2S, S, NH4, Fe2+等還原型化學(xué)物質(zhì)的氧化獲得能量, 并將 CO2合成為有機(jī)碳[9]。正是這些細(xì)菌構(gòu)成了深海熱液噴口生物賴以生存的食物鏈的基礎(chǔ)(表1)。

表1 熱液噴口環(huán)境中潛在存在的化能無機(jī)營養(yǎng)菌及其電子來源[10]

2 深海熱液噴口微生物多樣性

起初, 深海熱液噴口的微生物多樣性的研究主要局限于樣品的顯微描述及有限物種的富集培養(yǎng)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步和系統(tǒng)發(fā)育方法的發(fā)展,對于深海熱液噴口微生物多樣性的認(rèn)識有了大大的提高[3]。目前, 越來越多的熱液微生物被成功地培養(yǎng)或鑒別出來。盡管如此, 相對于熱液噴口環(huán)境中極其豐富的微生物資源來說, 這些僅占一小部分, 熱液環(huán)境中還有大量的未知微生物資源有待進(jìn)一步的研究和開發(fā)利用[15]。

2.1 深海熱液噴口古菌

盡管在某些熱液硫化煙囪中古菌可能僅占總細(xì)胞的較少一部分, 但它們卻是煙囪結(jié)構(gòu)某一特定部位微生物群落的主要組成成分[11-13]。例如, Takai等[14]利用熒光定量PCR和FISH技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)印度洋中脊 Kairei熱液區(qū)域的硫化煙囪內(nèi)部古菌比例將近達(dá)到 100%; Schrenk等[15]的研究結(jié)果表明在胡德安富卡脊, 古菌約占活性硫化煙囪外壁結(jié)構(gòu)中所有微生物的 40%, 且古菌數(shù)量從煙囪的外壁向中心部位呈逐漸遞增的趨勢。其他的研究也表明古菌多樣性比預(yù)計的要高。由Takai等[11]命名為“深海熱液噴口廣古菌類群”(DHVEG)的微生物在全球深海噴口系統(tǒng)中估計均有分布。這一類群可再分為兩個亞類群, 即DHVE-1和DHVE-2[16]。在幾個深海熱液環(huán)境的古菌16S rRNA 克隆文庫中, DHVEG占克隆的絕大多數(shù),其中DHVE-1高達(dá)總克隆數(shù)的93%。

表2 深海熱液噴口環(huán)境中的古菌多樣性

深海熱液環(huán)境中的古菌主要包括泉古菌, 廣古菌和初古菌門 3大類群[11-12]。表 2總結(jié)了深海熱液噴口環(huán)境中的主要古菌類群及其特征。初古菌只在環(huán)境樣品的16S rRNA文庫中檢測到, 并未見有可培養(yǎng)菌株的報道。事實上, 可培養(yǎng)菌株在深海熱液環(huán)境樣品古菌克隆文庫中的比例極小。熱球菌目(Thermococcales)是熱液噴口中最常被分離培養(yǎng)的超嗜熱古菌, 這些微生物被認(rèn)為是海洋熱液生態(tài)系統(tǒng)中最主要的分解者[14-15]。它們是一類嚴(yán)格厭氧, 能夠以酵母, 蛋白胨, 淀粉等做生長底物的異養(yǎng)微生物,還具有還原元素硫的能力。據(jù)推測, 在深海熱液噴口,復(fù)雜的生物群落能為熱球菌的生長繁殖提供有機(jī)質(zhì),因此認(rèn)為超嗜熱的熱球菌可能是熱液噴口異養(yǎng)活動的良好指示者[17]。甲烷八疊球菌目(Methanosarcinales)的產(chǎn)甲烷菌也經(jīng)常能在克隆文庫中檢測到,但是這類微生物至今還無法實現(xiàn)分離培養(yǎng)[15]。

廣古菌門中, 古丸菌屬(Archaeoglobus)的兩個硫酸鹽還原菌和幾株產(chǎn)甲烷菌(利用 CO2和 H2產(chǎn)生CH4)研究較多。與古丸菌親緣關(guān)系較近的地丸菌屬(Geoglobus)可利用 Fe3+作為電子受體。甲烷球菌屬(Methanococcus)和甲烷嗜熱菌屬(Methanopyrus)是嗜熱產(chǎn)甲烷菌的代表菌屬[18], 具有典型的高溫生長特性(最適生長溫度98℃, 最高生長溫度110℃)。泉古菌是深海熱液噴口古菌的第二類群, 這類微生物基本都是可代謝硫和含硫化合物的超嗜熱古菌。此類群中已有幾個菌屬的代表菌株從深海熱液噴口環(huán)境中成功的分離得到, 如除硫菌屬(Desulfurococcus),葡萄熱菌屬(Staphylothermus), 熱網(wǎng)菌屬(Pyrodictium)和火葉菌屬(Pyrolobus), 這些分離菌株均是嚴(yán)格厭氧菌, 但卻表現(xiàn)為不同的代謝類型。延胡索酸火葉菌(Pyrolobus fumarii)[19]是一種能夠在最高113℃的溫度下生長的深海熱液噴口古菌(最適生長溫度106℃), 它能以硝酸鹽, 硫代硫酸鹽為底物, 可在微氧條件下生長。這是至今地球上已知的最嗜熱的微生物, 更重要的是, 它能在 120℃高壓蒸汽滅菌鍋中存活2 h。

表3 深海熱液噴口環(huán)境中細(xì)菌多樣性

由于騎行納古菌(Nanoarchaeum equitans)的發(fā)現(xiàn), 提出了一個新的古菌門： 納古菌門(Nanoarchaeota)[20]。Nanoarchaeum equitans是一種與古菌Ignicoccus pacificus密切關(guān)聯(lián)的微小(400 nm)微生物。

2.2 深海熱液噴口細(xì)菌

高達(dá) 350℃的噴口熱液流的出現(xiàn)使微生物學(xué)家對深海熱液噴口微生物的研究主要集中在超嗜熱古菌的研究上。然而, 分子生物學(xué)技術(shù)的利用揭示了細(xì)菌群落在深海熱液噴口生境中的豐富度及重要性。表 3總結(jié)了深海熱液噴口環(huán)境中主要細(xì)菌類群及其特征。其中ε-變形菌又是細(xì)菌類群中較為豐富, 分布較為廣泛的亞門[15]。某些 ε-變形菌常與熱液噴口的腹足動物共生[21], 有些甚至是蝸牛內(nèi)共生菌[22]。盡管 ε-變形菌的分布極為普遍, 但是由于其難培養(yǎng)性,我們對這類微生物的生理生化特征卻知之甚少。先前的研究認(rèn)為 ε-變形菌主要是微氧硫氧化菌[23]。最近的研究表明 ε-變形菌具有更豐富的代謝多樣性[23]。研究表明, 深海熱液噴口ε-變形菌主要由能以硝酸鹽, 氧氣, 硫化合物為最終電子受體, 從而氧化氫氣和硫化合物的嗜中溫或嗜熱的化能無機(jī)營養(yǎng)菌組成[23]。一般認(rèn)為, ε-變形菌不僅在深海熱液噴口的硫循環(huán)中發(fā)揮重要作用, 而且還參與熱液噴口的氫,氮, 碳循環(huán)[24]。

產(chǎn)水菌目(Aquificales)是深海熱液噴口化能無機(jī)營養(yǎng)型的另一代表類群, 它們所利用的電子受體和供體與 ε-變形菌相似[25]。如 ε-變形菌一樣, Aquificales亦普遍分布于全球的深海熱液區(qū)域[25]。由Aquificales高的生長溫度可以預(yù)測, 這類微生物只可能發(fā)現(xiàn)于像活性硫化煙囪或噴口熱液流等高溫環(huán)境中[16]。

深海熱液噴口中已知的非光合細(xì)菌主要包括硬壁菌門(Firmicutes), 疣微菌門(Verrucomicrobia), 棲熱菌(Thermales)和嗜胞菌-屈撓桿菌-擬桿菌(Cytophaga-Flexibacter- Bacteroides, CFB)四類。Verrucomicrobia已分別從胡德安富卡脊, 東北太平洋脊和瓜伊馬斯盆地的許多熱液位點鑒別出來[23]。這類細(xì)菌難于培養(yǎng), 研究者曾在 70℃的復(fù)合有機(jī)營養(yǎng)富集培養(yǎng)基中通過不斷選擇培養(yǎng)獲得了一株新的Verrucomicrobia菌株, 但卻無法穩(wěn)定傳代培養(yǎng)。

在深海熱液噴口環(huán)境樣品的克隆文庫中還鑒別出一類屬于綠彎菌門的綠色非硫細(xì)菌[21]。深海熱液噴口系統(tǒng)的地理化學(xué)特征為非光合作用的綠色非硫細(xì)菌提供了合適的生境, 比如在瓜伊馬斯盆地, 有機(jī)質(zhì)通過熱分解轉(zhuǎn)換成了各種石油碳?xì)浠衔? 包括不分枝烷烴, 環(huán)烷烴, 三萜, 甾烷和芳香碳?xì)浠衔? 從而為綠色非硫細(xì)菌的生長繁殖提供底物[24]。

最近, 一些研究利用功能基因的方法大大擴(kuò)展了異化性硫酸鹽還原菌(SRB)的多樣性[11]。研究者使用dsrAB基因為分子標(biāo)尺, 不僅擴(kuò)展了SRB的分布和多樣性, 而且表明 SRB不僅分布于熱液沉積物中還分布在活性硫化煙囪壁中。另外, dsrAB基因的系統(tǒng)發(fā)育調(diào)查還揭示了原先未被培養(yǎng)的和未被識別的潛在SRB的存在[26]。這些SRB對局部微環(huán)境的化學(xué)特征及礦化過程產(chǎn)生重要影響, 同時在深海熱液噴口生態(tài)系統(tǒng)中硫化礦的沉積和變更中發(fā)揮重要作用[27]。為了揭示硫酸鹽還原菌在深海熱液噴口發(fā)揮的潛在地理生物學(xué)作用, Hoek和Reysenbach調(diào)查了一株嗜熱的, 氫氧化硫酸鹽還原菌在硫化煙囪的陡峭地理化學(xué)梯度條件下是如何分餾硫同位素的。結(jié)果顯示,分餾的程度主要依賴于環(huán)境中氫氣的濃度。在氫氣有限的條件下,34S標(biāo)記的硫化物只減少了原硫酸鹽的4‰。這個結(jié)果表明化學(xué)無機(jī)營養(yǎng)型的硫酸鹽還原菌在深海熱液噴口生物地球化學(xué)循環(huán)中發(fā)揮重要作用。

像鐵氧化菌一樣的金屬氧化菌是硫化物微生物風(fēng)化的重要促進(jìn)者, 在深海熱液噴口金屬和硫的生物地球化學(xué)循環(huán)中發(fā)揮著重要作用[28-29]。McCollum等[30]認(rèn)為由每千克熱液流沉淀下來的金屬硫化物氧化產(chǎn)生的能量超過其中溶解化合物(H2S, CH4, Mn2+,H2)所產(chǎn)能量幾乎一個數(shù)量級。Edwards等[28]調(diào)查了海底環(huán)境中鐵氧化細(xì)菌在硫化礦的 Fe2+氧化過程的作用。將煙囪硫化物的拋光片放置于海底溫度約4℃的環(huán)境, 會在其上形成微生物菌落, 菌落密度與礦物基質(zhì)的可溶性成正比。觀察拋光片上隨之形成的鐵氧化物發(fā)現(xiàn)鐵氧化物是隨著細(xì)菌的生長而形成的。Edwards等[29]利用原位培養(yǎng)方法分離到鐵氧化菌,進(jìn)一步證實了鐵氧化菌的存在和活動與熱液噴口硫化物密切相關(guān)。分離菌株的系統(tǒng)發(fā)育分析表明它們是與已知鐵氧化菌關(guān)系較遠(yuǎn)的 α或 γ變形菌。這些結(jié)果表明鐵氧化菌普遍存在并活躍于海底熱液噴口環(huán)境中。

2.3 深海熱液噴口微生物生理生化多樣性

深海熱液噴口環(huán)境陡峭的化學(xué)和物理梯度為微生物的生長提供了多種多樣的生境和能源, 從而造就了這一環(huán)境中微生物的高度多樣性。例如, 化能無機(jī)營養(yǎng)型微生物可以通過氧化性海水(O2, N O3-和)和還原性熱液流(H2, H2S, CH4, CO2和甲酸鹽)之間的化學(xué)梯度引起的氧化還原反應(yīng)獲得能量。雖然已從深海熱液環(huán)境中成功的分離培養(yǎng)出來了一系列化能無機(jī)營養(yǎng)型微生物[5], 但這只占一小部分, 仍有大量是未培養(yǎng)的, 其中有些是利用稀有或罕見氧化還原力偶獲取能量生長的[31]?？梢? 能利用多種電子供體和受體的微生物更適合于深海熱液噴口多變的環(huán)境和陡峭的梯度條件。這些細(xì)菌也可以在缺氧區(qū)域以 N O3-, S2O32-, Fe3+和Mn4+代替氧作為氧化劑進(jìn)行生長繁殖。許多深海嗜熱菌, 包括兼性厭氧的Pyrolobus fumarii[19], 產(chǎn)水菌目成員[25], 除硫桿菌[32]和 ε-變形菌[24], 均表現(xiàn)出代謝多功能性, 以使它們在物理化學(xué)梯度多變的環(huán)境中生長良好。

深海熱液噴口環(huán)境無機(jī)碳的同化方式相當(dāng)多樣,且與其物理化學(xué)條件密切相關(guān)。超嗜熱廣古菌, 如產(chǎn)甲烷菌和古丸菌, 通常分布在熱液環(huán)境中溫度最高的部位, 并且利用乙酰輔酶 A途徑進(jìn)行 CO2的固定[33]。深海熱液噴口環(huán)境中超嗜熱泉古菌門的除硫球菌, 如火葉菌屬, 熱網(wǎng)菌屬, 除硫球菌屬, 燃球菌屬, 碳固定途徑仍然無法確定, 在分析了熱網(wǎng)菌科和除硫球菌科的酶系之后推測它們分別利用特殊的卡爾文循環(huán)和一種潛在新的碳固定途徑[34]。據(jù)證明,在混合區(qū)的較低溫度下, 海洋泉古菌 I組(MGI)是最主要的古細(xì)菌組成成分。古菌膜脂的穩(wěn)定性放射性碳同位素分析表明不可培養(yǎng)的海洋泉古菌 I組古菌通過 3-羥基丙酸途徑固定碳酸氫鹽自養(yǎng)生長[35]。細(xì)菌域中, 還原性三羧酸(rTCA)循環(huán)可能是產(chǎn)水菌目產(chǎn)水菌科和Persephonella科最主要的CO2固定途徑之一。另外, 深海ε-和γ-變形菌碳固定途徑中關(guān)鍵功能基因的系統(tǒng)發(fā)育分析和酶的分析表明 rTCA循環(huán)可以作為深海 ε-變形菌的 CO2固定途徑, 并與 γ-變形菌的卡爾文循環(huán)一起共同促進(jìn)微生物群落的初級生產(chǎn)[36]。

耐受陡峭變化的物理化學(xué)梯度是深海熱液噴口微生物的一個重要生理特征。溫度和靜水壓對異養(yǎng)超嗜熱微生物生存的影響已被廣泛研究[37]。所有的研究清楚地顯示靜水壓力升高可顯著提高耐熱性,只不過在不高于 120℃的條件下, 耐受程度均在幾分鐘到幾十分鐘之間。120℃以上熱液流中超嗜熱菌的實驗室培養(yǎng)與原位觀察之間的差距仍是一個謎,有待進(jìn)一步研究。由于隨著熱液流與周圍海水的混合形成了潛在的有毒金屬梯度, 對金屬毒性的耐受性和敏感性也是深海熱液噴口微生物的重要生理特征。Vetriani等[38]曾假設(shè)金屬對微生物群落的毒性可能隨著重金屬濃度的降低而增加(氧化性海水稀釋比例的升高導(dǎo)致熱液流中重金屬濃度的降低), 這與增加的生物可利用性和溶解度相關(guān)。這個假設(shè)已被實驗證實, 實驗結(jié)果表明來自較高溫度和較強(qiáng)還原性生境中的嗜熱細(xì)菌和古菌對有毒金屬更敏感, 而來自較低溫度和較強(qiáng)還原性生境中的中溫微生物顯示出對有毒金屬的更高的耐受性[38]。顯然, 每一個物理化學(xué)參數(shù)對于單個微生物的生長和生存都有相當(dāng)大的影響, 但是對于這些物理化學(xué)參數(shù)在群落水平的潛在相互作用卻不甚了解。

3 深海熱液噴口微生物群落研究方法

微生物學(xué)家在研究微生物多樣性上面臨著特殊的挑戰(zhàn)。宏觀生物學(xué)家可以通過形態(tài)學(xué)特征來識別新的物種, 而微生物學(xué)家則必須依靠生理特征和系統(tǒng)發(fā)育特征才能鑒別新的微生物物種, 更甚者對于許多微生物物種的定義還存在爭議。

3.1 傳統(tǒng)的培養(yǎng)技術(shù)

傳統(tǒng)微生物多樣性的研究方法依賴于微生物的實驗室培養(yǎng), 它主要以細(xì)胞形態(tài), 生長溫度, pH值,生物量, 呼吸效率, 酶活性等為依據(jù)。然而, 在實驗室重建自然環(huán)境的精確物理化學(xué)條件是很困難的,因此, 利用傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法研究微生物多樣性通常會導(dǎo)致極大的偏差, 而且通過人工培養(yǎng)獲得的微生物只占自然環(huán)境中很小的一部分(0.001%～1.5%)。對于深海熱液噴口微生物來說, 開發(fā)合適的培養(yǎng)基和在實驗室重建這種極端環(huán)境更是極其困難的, 這種培養(yǎng)偏差就更加嚴(yán)重。但是這種傳統(tǒng)的實驗室培養(yǎng)方法對于認(rèn)知深海熱液噴口微生物的生理多樣性至關(guān)重要。例如, 生長在105℃以上溫度下的古菌的鑒別擴(kuò)展了生命的最高溫度極限[19]; 另外通過培養(yǎng)方法在深海熱液噴口區(qū)鑒別出了可利用多種電子供體和受體生長的微生物。目前, 又發(fā)展了許多改進(jìn)的培養(yǎng)方法應(yīng)用于深海熱液噴口微生物的研究, 例如,針對難培養(yǎng)微生物和不可培養(yǎng)微生物的原位培養(yǎng)法;BIOLOGY微量平板法。盡管如此, 僅僅通過傳統(tǒng)培養(yǎng)方法遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足對深海熱液噴口微生物群落及其功能的研究。然而分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步, 特別是一些利用 rRNA分子及其編碼基因的技術(shù)極大的彌補(bǔ)了傳統(tǒng)方法的不足。

3.2 分子生物學(xué)方法

目前, 深海熱液噴口微生物多樣性的調(diào)查研究主要采用分子生物學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育分析的方法, 避免了微生物的培養(yǎng)。此方法主要依賴于高度保守的rRNA分子亞單位基因和微生物代謝過程中編碼關(guān)鍵酶的功能基因。Cary等[39]綜述了這些分子系統(tǒng)發(fā)育方法, 并詳盡的闡述了分子生態(tài)技術(shù)應(yīng)用在深海熱液噴口微生物群落研究上的新進(jìn)展。如圖 2總結(jié)了微生物群落結(jié)構(gòu)和功能研究的技術(shù)方法[40]。簡而言之, 首先從環(huán)境樣品中抽提基因組 DNA或 RNA,然后通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)從基因組 DNA或cDNA中擴(kuò)增16S rRNA。擴(kuò)增產(chǎn)物可通過諸如克隆文庫或指紋圖譜技術(shù)(RFLP, DGGE, TGGE, SSCP)等幾種方法進(jìn)行分選。由此鑒別出的獨特克隆子或單一條帶進(jìn)行序列測定, 從而構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析, 推測其分類地位, 進(jìn)而揭示深海熱液環(huán)境微生物多樣性。另外, 序列信息可以用于設(shè)計特異性分子探針或引物, 通過點印記技術(shù)或原位雜交技術(shù)來鑒別樣品中的特有微生物物種; 或者通過熒光原位雜交(FISH)和實時定量 PCR技術(shù)來研究復(fù)雜環(huán)境樣品中獨特微生物類群的分布或豐度。

微生物群落功能多樣性可利用一系列不同的分子方法來研究, 并可以將其與分子系統(tǒng)發(fā)育多樣性進(jìn)行比較。目前, 16S rRNA由于其高度保守性和特異性, 是研究微生物群落最常用的分子標(biāo)尺, 然而它卻不能直接反應(yīng)微生物的代謝與生理特性。一個微生物群落的潛在代謝功能可通過檢測特定代謝過程中專一的基因或 mRNA來推測。例如, 異質(zhì)性硫酸鹽還原過程中的關(guān)鍵酶, 異化亞硫酸鹽還原酶,是由dsrAB基因所編碼的, 可以通過研究dsrAB基因來研究深海熱液噴口中的硫酸鹽還原菌和硫酸鹽還原活動[28]。另一個常被調(diào)查的功能基因是mcrA基因,它編碼甲烷產(chǎn)生過程中的關(guān)鍵酶, 甲基輔酶 M還原酶α亞基。mcrA基因已從多種不同的深海熱液噴口環(huán)境中檢測到[41]。

更詳細(xì)的微生物群落功能多樣性可以通過宏基因組方法來研究, 這一方法最終為研究不可培養(yǎng)的微生物多樣性和生理功能指明了方向[42]。宏基因組學(xué)是一種對直接來自于環(huán)境樣品中的微生物群體基因組進(jìn)行研究的新的微生物研究領(lǐng)域。通過直接從環(huán)境樣品中提取全部微生物的基因組, 構(gòu)建宏基因組文庫, 從而研究環(huán)境樣品所包含的全部微生物的遺傳組成及其群落功能。這種方法避開了環(huán)境微生物分離培養(yǎng)的難題, 在挖掘和利用未培養(yǎng)微生物資源, 篩選新穎生物活性物質(zhì)方面具有極大的潛力。目前, 宏基因組研究已滲透到生物學(xué)的各個研究領(lǐng)域,在海洋極端環(huán)境微生物研究、深海微生物多樣性探索中具有十分重要的應(yīng)用前景。

圖2 微生物群落結(jié)構(gòu)研究的技術(shù)方法[40]

4 展望

深海熱液噴口微生物群落是深海生物圈的一個重要組成部分, 極端的生存環(huán)境使得這些生物具有十分獨特的生理生化特征和能量代謝途徑, 對這些獨特微生物資源開發(fā)利用的前景非常廣闊。然而由于其特殊的生存環(huán)境, 深海熱液噴口微生物的實驗室分離培養(yǎng)較為困難, 因此改進(jìn)對熱液微生物的篩選、分離和培養(yǎng)技術(shù), 提出新思路, 設(shè)計新的分離程序, 盡可能多地分離未知微生物, 了解它們在海洋生態(tài)環(huán)境中的作用, 是深海熱液噴口微生物資源開發(fā)利用的重要前提和關(guān)鍵之一。

另外, 深海底生物處于獨特的物理、化學(xué)和生態(tài)環(huán)境中, 尤其熱液噴口區(qū)的生物在高壓、劇變的溫度梯度和高濃度的有毒物質(zhì)包圍下, 形成了極為獨特的生物結(jié)構(gòu)、代謝機(jī)制, 體內(nèi)產(chǎn)生了特殊的生物活性物質(zhì), 例如嗜堿、耐壓、嗜熱、嗜冷、抗毒的各種極端酶。這些特殊的生物活性物質(zhì)功能各異, 是深海底生物資源中最具應(yīng)用價值的部分。可以預(yù)料, 深海熱液生物資源在工業(yè)、醫(yī)藥、環(huán)保等領(lǐng)域?qū)l(fā)揮重大的經(jīng)濟(jì)價值。

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Q938.8

A

1000-3096(2012)06-0113-09

2011-12-05;

2012-02-23

國家自然科學(xué)基金項目(40646029); 教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計劃(NECT-06-0691); 國際海底區(qū)域研究開發(fā)“十一五”項目(DYXM-115-02-2-07); 海洋公益性行業(yè)科研專項經(jīng)費(fèi)資助項目(200805032)

魏曼曼(1982-), 女, 碩士研究生, 研究方向： 微生物生態(tài)學(xué),電話： 13764230368, E-mail： wwyymm_6@163.com

(本文編輯：梁德海)