山西野生卷丹百合鱗莖組織培養(yǎng)

馬素嫻，田志強(qiáng)，亢秀萍

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，山西太谷030801）

卷丹百合（Lilium lanclfolium）又名虎皮百合，為百合科百合屬多年生球根類花卉，鱗莖卵圓形至扁球形、黃白色，地下莖易生小鱗莖，地上莖多生珠芽[1]。其在我國各地均有野生分布，具有較高的觀賞、食用和藥用價值[2]。卷丹百合一般采用小鱗莖分球繁殖和珠芽繁殖，但長期營養(yǎng)繁殖容易造成種性退化[3-4]。

通過組織培養(yǎng)技術(shù)，能在短期內(nèi)更新品種，生產(chǎn)脫毒苗，具有較高的經(jīng)濟(jì)價值和開發(fā)潛力。目前，國內(nèi)對百合栽培種的組織培養(yǎng)較多[5-6]，而對適應(yīng)性極廣的野生種自然三倍體卷丹的研究甚少。

本研究以野生卷丹百合鱗莖鱗片為外植體，以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，研究不同激素配比及添加不同質(zhì)量濃度蔗糖的培養(yǎng)基對卷丹百合不定芽、愈傷組織及不定芽生根的誘導(dǎo)效果，旨在為今后野生卷丹百合大規(guī)模繁殖及生產(chǎn)提供理論依據(jù)與技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

野生卷丹百合鱗莖于2011年10月采集自山西省蘆芽山自然保護(hù)區(qū)。該區(qū)地理位置為：東經(jīng) 111°56′07 ″，北緯 38°45′23″，海拔為2 600 m。鱗莖于5℃低溫冰箱中保存。試驗中，初代培養(yǎng)材料為內(nèi)層、中層、外層鱗莖鱗片，各處理數(shù)均為20。小芽繼代培養(yǎng)，每個處理以20個長勢均一的小芽為材料；愈傷組織繼代培養(yǎng)，每個處理為20個長勢均一的愈傷顆粒。

1.2 試驗方法

將卷丹百合鱗莖用自來水沖洗干凈，并用手術(shù)刀把鱗莖分成外、中、內(nèi)3部分（外圍2～3層鱗片為外部鱗片，中心較嫩的2～3層為內(nèi)部鱗片，其余為中部鱗片），剔除腐爛的鱗片，用流水沖洗3～4 h，先用75%酒精表面滅菌30 s，無菌水沖洗2次；再在0.1%氯化汞溶液中進(jìn)行滅菌，用無菌水沖洗5次。

滅菌后將每片鱗片切成0.2 cm×0.2 cm切塊，接種到添加有不同激素的MS培養(yǎng)基上，其中蔗糖3%，瓊脂0.68%，pH值為5.8。培養(yǎng)條件為：光照強(qiáng)度 2 000 lx，培養(yǎng)溫度（25±1）℃[7]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel和SAS軟件進(jìn)行統(tǒng)計與分析。

小芽直徑增加百分率＝（繼代培養(yǎng)后平均直徑－繼代培養(yǎng)前平均直徑）/繼代培養(yǎng)前平均直徑×100%；愈傷組織質(zhì)量增加百分率＝（繼代培養(yǎng)后平均鮮質(zhì)量－繼代培養(yǎng)前平均鮮質(zhì)量）/繼代培養(yǎng)前平均鮮質(zhì)量×100%；生根率＝生根小鱗莖數(shù)/總小鱗莖數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素對鱗莖鱗片的誘導(dǎo)

將滅菌完成后的卷丹百合鱗莖鱗片切去鱗莖盤并產(chǎn)生切口，接種到含有不同植物激素濃度的培養(yǎng)基上。5 d后，外層鱗片首先變綠，其次中層鱗片變綠，內(nèi)層鱗片最后變綠。12 d后鱗片切口處出現(xiàn)白色芽點(diǎn)，19 d后芽點(diǎn)逐漸轉(zhuǎn)為綠色并開始膨大。33 d后芽點(diǎn)膨大為小芽，50 d后統(tǒng)計每個處理中內(nèi)層、中層、外層鱗莖鱗片小芽數(shù)和產(chǎn)生愈傷組織的鱗莖鱗片數(shù)。試驗結(jié)果及方差分析如表1所示。

表1 不同激素對鱗莖鱗片芽點(diǎn)的誘導(dǎo)情況

由表1可知，NAA和6-BA對鱗莖鱗片芽點(diǎn)及愈傷組織的誘導(dǎo)影響均顯著。當(dāng)NAA質(zhì)量濃度與6-BA質(zhì)量濃度比值介于1/20～1/10之間時，分化為芽點(diǎn)能力較高，且最佳誘導(dǎo)激素組合為NAA 0.1 mg/L，6-BA 2.0 mg/L；當(dāng) NAA質(zhì)量濃度與6-BA質(zhì)量濃度比值介于1/5～1/2之間時，分化為愈傷組織能力較高，且最佳誘導(dǎo)激素組合為NAA0.2 mg/L，6-BA1.5 mg/L。由表1還可知，鱗莖鱗片的分化能力內(nèi)層、中層、外層依次增加。

2.2 不同質(zhì)量濃度蔗糖對繼代培養(yǎng)的影響

芽點(diǎn)逐漸膨大為小芽后，由于母體營養(yǎng)耗盡，其生長速度下降。為了保持小芽繼續(xù)膨大為小鱗莖的生長速度，將其與母體材料分離，選擇大小均一的小鱗莖轉(zhuǎn)接到MS培養(yǎng)基上，通過改變蔗糖質(zhì)量濃度，觀察小鱗莖生長和愈傷組織生長量的變化。由于培養(yǎng)基在60 d后可能出現(xiàn)失水等退化現(xiàn)象，會影響材料吸收營養(yǎng)，因此，繼代培養(yǎng)50 d后，測量并統(tǒng)計繼代小芽和愈傷組織生長量。試驗結(jié)果及方差分析如表2所示。

由表2可知，不同質(zhì)量濃度蔗糖對小芽和愈傷組織繼代培養(yǎng)的生長量影響顯著。由圖1可知，蔗糖質(zhì)量濃度低時，小芽和愈傷組織的生長速度受到限制；質(zhì)量濃度達(dá)到40 g/L時，愈傷組織生長量達(dá)到最大；質(zhì)量濃度達(dá)到50 g/L時，小芽生長量最大，但愈傷組織生長量下降，且發(fā)生褐化現(xiàn)象。試驗還發(fā)現(xiàn)，隨著蔗糖質(zhì)量濃度的增加，小芽由綠轉(zhuǎn)變?yōu)榧t褐色個數(shù)明顯增多；而相同質(zhì)量濃度下，小芽生長量仍有增加，但增加比率有所下降。因此，繼代培養(yǎng)小芽和愈傷組織時，可選用添加蔗糖40 g/L的MS培養(yǎng)基。

表2 不同質(zhì)量濃度蔗糖對小芽和愈傷組織繼代培養(yǎng)的影響

2.3 不同質(zhì)量濃度蔗糖對小鱗莖生根的影響

進(jìn)行小芽繼代培養(yǎng)10 d后，發(fā)現(xiàn)大量小鱗莖膨大，同時底部出現(xiàn)黃色小點(diǎn)；20 d左右可明顯觀察到多條小根，出現(xiàn)生根現(xiàn)象。30 d統(tǒng)計每個小芽生根情況。統(tǒng)計結(jié)果及方差分析列于表3。

表3 不同質(zhì)量濃度蔗糖對小鱗莖生根的影響

由表3可知，隨著蔗糖質(zhì)量濃度增加（由于能量物質(zhì)供應(yīng)充足），小鱗莖生根率和生根數(shù)明顯增加。從圖2，3可直觀看出，當(dāng)蔗糖質(zhì)量濃度達(dá)到40 g/L時，生根率和生根數(shù)達(dá)到最大；蔗糖質(zhì)量濃度達(dá)50 g/L時，生根率和生根數(shù)出現(xiàn)明顯下降，且發(fā)生明顯褐化現(xiàn)象。同時，試驗時觀察發(fā)現(xiàn)，質(zhì)量濃度為40 g/L蔗糖下，新生根較添加其他質(zhì)量濃度的培養(yǎng)基中的粗壯。因此，誘導(dǎo)生根可采用添加蔗糖40 g/L的MS培養(yǎng)基。

2.4 煉苗與移栽

將已生根的小鱗莖幼苗打開瓶蓋煉苗3～7 d后，取出洗去根上的培養(yǎng)基，定植于裝有1/3草炭＋1/3珍珠巖＋1/3河沙混合基質(zhì)的營養(yǎng)缽內(nèi)，澆透水，蓋上薄膜，使其保持高溫高濕的環(huán)境。其中，草炭可供以根系水分與營養(yǎng)物質(zhì)；珍珠巖可確?；|(zhì)內(nèi)有空氣，利于組培苗成活；河沙可增加基質(zhì)排水力，提高根系呼吸強(qiáng)度。10 d后，逐漸揭去薄膜，讓組培苗逐漸適應(yīng)外界環(huán)境，緩沖2種環(huán)境下苗體的不適反應(yīng)。30 d后，將營養(yǎng)缽內(nèi)幼苗移栽至室外，正常管理，使其自然生長。

3 結(jié)論與討論

野生卷丹百合在我國分布極廣，抗性強(qiáng)，是少見的三倍體種。本研究表明，誘導(dǎo)鱗莖鱗片不定芽與愈傷組織的最佳培養(yǎng)基，可以通過調(diào)節(jié)6-BA與NAA不同配比實現(xiàn)；質(zhì)量濃度為40～50 g/L的蔗糖對不定芽與愈傷組織繼代培養(yǎng)影響較大。同時發(fā)現(xiàn)，質(zhì)量濃度為30～40 g/L的蔗糖對不定芽生根重大意義，生根率高達(dá)89.97%。段祖安等[8]對卷丹鱗莖鱗片的誘導(dǎo)培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn)，不同質(zhì)量濃度蔗糖對其分化影響效果不明顯。

試驗中將鱗莖鱗片分為內(nèi)層、中層、外層鱗片，并觀察記錄整個組織培養(yǎng)生長情況，結(jié)果表明，各激素配比培養(yǎng)基中產(chǎn)生不定芽和愈傷組織量情況，都表現(xiàn)為外層＞中層＞內(nèi)層，說明鱗片由內(nèi)向外，生長勢趨向增大。郭海濱等[9]對卷丹鱗莖、杭玲等[10]對蘭州百合鱗片的組織培養(yǎng)研究中也得到了相同的結(jié)論。此外，將鱗片以內(nèi)層、中層、外層加以區(qū)分，在滅菌過程中施以不同滅菌處理，也會對試驗大有裨益。

通過本試驗，得到野生卷丹百合鱗莖組織培養(yǎng)的有效途徑與影響因素，可為野生三倍體卷丹的低成本生產(chǎn)與快繁提供理論依據(jù)和具體措施。

[1]中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會.中國植物志（4卷）[M].北京：科學(xué)出版社，2004：152.

[2]山西省植物志編輯委員會.山西植物志（5卷）[M].北京：中國科學(xué)技術(shù)出版社，2004：167-188.

[3]李謀智.食用百合組織培養(yǎng)快繁技術(shù)研究 [J].北方園藝，2006（1）：101-102．

[4]邵小斌，周翔，徐艷，等.野生百合：卷丹的組織培養(yǎng)初探[J].天津農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，16（4）：18-19.

[5]陳貴華，石嶺，吳玉峰.卷丹百合組織培養(yǎng)研究[J].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2009（12）：61-64.

[6]樊蘭瑛，高宏樟，郭常蓮.東方百合組培快繁試驗[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（9）：29-32.

[7]趙強(qiáng)，李慶典，趙玉嶺.青島百合的組織培養(yǎng)技術(shù)研究[J].北方園藝，2007（6）：213-214.

[8]段祖安，王洪利，趙艷燕，等.卷丹百合組培快繁技術(shù)的研究[J].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2009，40（4）：495-497.

[9]郭海濱，雷家軍.卷丹百合鱗片及珠芽組織培養(yǎng)研究[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2006（2）：72-74.

[10]杭玲，蘇賓，陳立新，等.龍牙百合組培快繁技術(shù)研究[J].廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2001（4）：183-184.