HPLC法測定丹芪偏癱膠囊成品中丹酚酸B的含量*

閻雪梅，陳 濤

(天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300193)

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters高效液相色譜儀∶waters600型HPLC泵，2998二極管陣列檢測器(DAD)，Empower色譜工作站，A1104型分析天平(上海分析儀器廠)。

1.2 試藥 丹酚酸B(中國藥品生物制品檢定所，批號111562－200504)，乙腈、甲酸，冰乙酸均為色譜純，甲醇、乙醚、正丁醇、氨水均為分析純，超純水(自制)。丹芪偏癱膠囊(天津市石天藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號dq2008045、dq2008046、dq2008047)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗［1－3］色譜柱:WatersSunfireTM C18(250 mm ×4.6 mm，5.0 μm)，流動相:乙腈－水－冰乙酸(30∶70∶1.2)，檢測波長:286 nm;流速:1.0 ml/min;柱溫:35 ℃;進樣量:20 μl;理論版數(shù)按丹酚酸B計應(yīng)不低于2 500。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液制備 精密稱取丹酚酸B對照品，用適量甲醇溶解，并定容至25 ml，搖勻，制成每1 ml含0.496 mg的丹酚酸B對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備 取丹芪偏癱膠囊內(nèi)容物1.6 g，精密稱定，置具塞三角瓶中，加入甲醇 40 ml，加熱回流1 h，提取液回收溶劑至干，殘渣加水40 ml，用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至3，靜置1 h后，用醋酸乙酯提取4次，每次25 ml，醋酸乙酯提取液水浴蒸干，殘渣用適量甲醇溶解，定容至5 ml，搖勻，濾過，作為供試品溶液。

2.2.3 陰性對照溶液的制備 按丹芪偏癱膠囊處方比例及工藝，制備成缺丹參的陰性濃縮液，再按照“2.2.2”項下方法制成缺丹參的陰性對照品溶液。

2.3 空白試驗 在上述色譜條件下，分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照液各20μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖(見圖1)。供試品色譜圖中，在與對照品色譜峰相應(yīng)保留時間處，有相同色譜峰，而陰性對照在此保留時間處無干擾。并且丹酚酸B色譜峰與相鄰色譜峰分離度符合要求，表明處方中其他組分對丹酚酸B含量測定無干擾。

圖1 對照品(A)供試品(B)陰性對照(C)HPLC色譜圖

2.4 線性關(guān)系 精密吸取 0.2、1.0、1.5、2.0 和 4.0 ml的對照品溶液，分別置于5 ml棕色量瓶中用甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別配制成 0.019 84、0.099 2、0.148 8、0.198 4 和0.396 8 mg/ml系列濃度的對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣20 μl。進樣后，記錄峰面積，以濃度X與峰面積Y進行線性回歸，得回歸方程為 Y=2.24 X －2.22(r=0.999 7)，表明丹酚酸B在0.019 84～0.396 8 mg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗 取濃度為0.148 8 mg/ml的對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣20μl，連續(xù)測定6次，記錄峰面積，RSD為 1.27%，結(jié)果表明精密度良好。

2.6 重現(xiàn)性試驗 取丹芪偏癱膠囊(dq2008045)，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別進樣 20 μl，記錄峰面積，RSD為1.48%，結(jié)果表明重現(xiàn)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗 取丹芪偏癱膠囊(dq2008045)，按“2.2.2”項下制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件于 0、2、4、8、12 和 24 h 時分別進樣 20 μl，進行含量測定，RSD為1.58%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。2.8 加樣回收率試驗 精密稱取丹酚酸B對照品10.98 mg，置于10 ml量瓶中，用醋酸乙酯超聲溶解，并稀釋至刻度，搖勻，備用。稱取已知含量的供試品(dq2008045，含量為 1.372 2 mg/g)6 份，每份 0.8 g，分別加入丹酚酸 B 對照品溶液1 ml，按“2.2.2”項下方法處理樣品，測定樣品并計算回收率，結(jié)果平均回收率為97.16%，RSD 為1.88%，見表1。

2.9 成品含量測定 取丹芪偏癱膠囊按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，均以20μl進樣，測定丹酚酸B含量。結(jié)果，3批樣品(dq20087045、dq2008046和dq2008047)中丹酚酸 B的含量分別為 1.372 2、1.355 8和 1.345 0 mg/g。

表1 丹酚酸B加樣回收率試驗結(jié)果(n=6)

3 討論

3.1 流動相的選擇 一般測定丹酚酸B的流動相系統(tǒng)為甲醇－乙腈－甲酸－水系統(tǒng)，因此以不同比例的甲醇－水、甲醇－酸水和乙腈－酸水為流動相進行比較試驗，考察對本品的分離效果，結(jié)果表明，本方法中乙腈－水－冰乙酸系統(tǒng)(30∶70∶1.2)為流動相時，丹酚酸B的分離效果較佳，色譜峰峰形較好，與相鄰組分均能達到基線分離。

3.2 丹芪偏癱膠囊提取的考查 丹芪偏癱膠囊中所含成分復(fù)雜，直接提取進樣所得譜圖峰多且分離度不好，故采用先提取后萃取的方法。丹酚酸B為酸性有效成分，因此考慮調(diào)節(jié)酸性以利于丹酚酸B的提取。經(jīng)檢測，用8%鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值分別為2、3、4和5，進行提取進樣。經(jīng)比較，當(dāng)pH為2時，丹酚酸B的含量較高，但是前面雜質(zhì)峰較高，因此確定pH為3。

1 房海燕，林桂濤，李 濤.HPLC法測定冠心丹參片中丹酚酸B的含量.山西輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報，2006，20(2):70

2 朱山寅，傅素華.HPLC法測定心可寧膠囊中丹酚酸B的含量.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2007，25(4):810

3 李曉紅，馮瑪莉，劉霞.高效液相色譜法測定丹芪養(yǎng)血顆粒中丹酚酸B 的含量.中南藥學(xué)，2008，6(6):557