半胱氨酰白三烯受體1參與魚藤酮誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的調(diào)節(jié)

余舒瑩，趙 冰，張霞燕，張曉燕，王艷芳，張麗慧，盧韻碧，魏爾清

(1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系，浙江杭州 310058;2.杭州師范大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部藥理學(xué)教研室，浙江杭州 310036)

魚藤酮是一種廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)的殺蟲(chóng)劑，在體外能損傷多巴胺能神經(jīng)元［1-2］，產(chǎn)生與帕金森病(Parkinson's disease，PD)病理特征相似的表現(xiàn)［3］。魚藤酮作為一種細(xì)胞毒性化合物，是特異性線粒體復(fù)合體I抑制劑，可選擇性地阻斷鐵-硫簇N2和泛醌Q的作用，導(dǎo)致線粒體呼吸鏈電子轉(zhuǎn)運(yùn)障礙，造成氧化應(yīng)激及ATP生成障礙，從而引起細(xì)胞損傷［4-5］。PC12細(xì)胞作為常用的PD細(xì)胞模型，是大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤克隆化的細(xì)胞株，其合成的酶類、表達(dá)的受體以及合成的神經(jīng)遞質(zhì)接近中腦多巴胺(dopamine，DA)神經(jīng)元［6］，已被廣泛用于 DA神經(jīng)元體外研究，特別是用于PD發(fā)病機(jī)制的研究。

花生四烯酸經(jīng)5-脂氧酶催化而生的成半胱氨酰白三烯(cysteinyl leukotrienes，CysLTs)，包括LTC4、LTD4和LTE4，是一類活性很強(qiáng)的炎癥介質(zhì)，其作用由 CysLT1和 CysLT2受體介導(dǎo)［7］。CysLTs經(jīng)PD誘變劑魚藤酮處理后，可激活 PC12 細(xì)胞 5-脂氧酶［8］，表明 CysLTs可能參與PD病變。魚藤酮還能增加小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞株BV2細(xì)胞CysLT1受體表達(dá)，提示CysLT1受體參與PD的炎癥調(diào)節(jié)過(guò)程［9］。本實(shí)驗(yàn)室以往的研究表明，腦缺血性損傷后，腦內(nèi)CysLT1表達(dá)增加［10］;CysLT1受體拮抗劑普魯司特和孟魯司特對(duì)腦缺血性損傷有保護(hù)作用［11-14］。但是，DA神經(jīng)元CysLT1受體是否也參與PD病變過(guò)程，CysLT1受體拮抗劑能否保護(hù)魚藤酮誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷尚待研究。本研究觀察CysLT1受體拮抗劑孟魯司特對(duì)魚藤酮引起PC12細(xì)胞損傷的作用，以及魚藤酮引起CysLT1受體的表達(dá)、分布變化。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 胰酶、多聚賴氨酸、魚藤酮、青霉素、鏈霉素、二苯基四氮唑溴鹽(MTT)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;DMEM高糖培養(yǎng)基和馬血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物技術(shù)有限公司;兔抗小鼠CysLT1受體多克隆抗體由本研究室制備［11］;異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的山羊抗兔IgG、CY3標(biāo)記的山羊抗兔IgG購(gòu)自美國(guó)Chemicon公司;孟魯司特(montelukast)由美國(guó)Merk公司贈(zèng)送。BX51熒光顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司;CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Forma Scientific公司;多波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(Elx800 Universal Micro-plate Recorder)購(gòu)自美國(guó) Bio-TEK公司;SDS-PAGE膠電泳轉(zhuǎn)膜裝置購(gòu)自美國(guó) BIORAD公司;ODYSSEY免疫印跡膜熒光成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)LI-COR Biosciences公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 高分化大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所，用含10%胎牛血清的高糖DMEM完全培養(yǎng)基(含青霉素105U/L、鏈霉素105μg/L)，在5%CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)，2～3 d傳代，相近代數(shù)的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。當(dāng)細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底面積80%～90%時(shí)，以0.25%胰酶消化3～4 min，將細(xì)胞收集到離心管中，1 000 r/min離心5 min后，棄上清。加入培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種在96孔和24孔中的細(xì)胞濃度分別為4 ×103/孔、2.5 ×l04/孔。細(xì)胞接種24 h后，進(jìn)行不同處理。

1.3 確定魚藤酮處理?yè)p傷濃度［15］及形態(tài)觀察、活性測(cè)定(MTT法)［16］PC12細(xì)胞種于96孔板，貼壁生長(zhǎng)24 h后，分別加入不同濃度魚藤酮(終濃度 0.3、1、3、10、30 μmol/L)，對(duì)照組換用培養(yǎng)液，然后放入5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并攝影。

為測(cè)定細(xì)胞活性，處理結(jié)束后小心吸棄96孔板每孔的培養(yǎng)液，加入100μL MTT溶液(0.5 mg/ml，DMEM 培養(yǎng)基配制)，在 5%CO2培養(yǎng)箱37℃繼續(xù)孵育2 h后，小心吸棄上清液，每孔加入100μL DMSO中止反應(yīng)，振搖使生成的formazan顆粒充分溶解，用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)570 nm處吸光值(OD570)，OD值大小反映細(xì)胞的存活，以正常對(duì)照組MTT吸光值為基數(shù)100%，以藥物處理組與正常對(duì)照組吸光值的百分比，計(jì)算存活細(xì)胞百分率。

1.4 Western blotting測(cè)定CysLT1受體蛋白用胰酶消化收集魚藤酮處理后的PC12細(xì)胞，以常規(guī)方法提取總蛋白，用考馬斯亮藍(lán)法做標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定提取液中的蛋白濃度。取100 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，先以100 V恒壓使Marker分開(kāi)，再以150 V恒壓繼續(xù)電泳，直至溴酚藍(lán)條帶到達(dá)分離膠底部。然后，300 mA電轉(zhuǎn)移90 min至硝酸纖維素膜，經(jīng)TBST漂洗后，放入含5%脫脂奶粉中，平放在平緩搖動(dòng)的搖床平臺(tái)上，室溫孵育120 min。取出硝酸纖維素膜，放入混有GAPDH(小鼠單克隆抗體1∶5000)及CysLT1受體(1∶500)的一抗中，4℃冰箱中過(guò)夜，再用TBST漂洗10 min，共3次，與抗兔IRDye700DX?偶聯(lián)或抗鼠IRDye800DX?偶聯(lián)的二抗(1∶5000)室溫孵育2 h，漂洗后，用凝膠成像系統(tǒng)攝像，利用Quality One軟件以GAPDH為內(nèi)參，結(jié)果以CysLT1受體和GAPDH的條帶光密度比值相對(duì)百分比表示。

1.5 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)細(xì)胞CysLT1受體的分布 PC12細(xì)胞種于24孔板的蓋玻片上，貼壁生長(zhǎng)24 h后，細(xì)胞經(jīng)不同濃度魚藤酮處理24 h及3 μmol/L魚藤酮處理不同時(shí)間后，收集玻片，以0.01 mol/L PBS輕輕漂洗，冰甲醇冰上固定 5 min，再用 0.01 mol/L PBS清洗3次，加5%非免疫羊血清室溫封閉2 h。每孔各加一抗(1∶500)，4℃孵育過(guò)夜;次日，PBS清洗3次后，加抗兔FITC標(biāo)記(綠色)或CY3標(biāo)記(紅色)的熒光二抗(1∶200)，在室溫下孵育2 h，PBS清洗3次，并用碳酸甘油緩沖液(含1∶1000 DAPI，染細(xì)胞核)封片。在熒光顯微鏡下觀察CysLT1受體在PC12細(xì)胞上的分布并攝影。

2 結(jié)果

2.1 魚藤酮誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷變化 魚藤酮(終濃度 0.3、1、3、10、30 μmol/L)處理 PC12細(xì)胞24 h后，光鏡下可見(jiàn)，隨著魚藤酮濃度的增大，細(xì)胞出現(xiàn)明顯的形態(tài)學(xué)改變，包括細(xì)胞突起變短、消失，細(xì)胞萎縮、變圓(圖1A);細(xì)胞活性明顯降低，分別降低至對(duì)照值的91%、81%、76%、76%、75%(P ＜0.05 ～0.01，圖 1B)。魚藤酮3 μmol/L的作用24 h的變化明顯、適度，因此，選擇該條件作為誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的條件。

2.2 CysLT1受體拮抗劑對(duì)魚藤酮誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的影響 常規(guī)培養(yǎng)條件下，孟魯司特0.2、1、5 μmol/L 作用24 h，對(duì)細(xì)胞活性沒(méi)有明顯影響，而 10 μmol/L輕度增高細(xì)胞活性［100.0 ±2.3 vs 106.3 ±4.5(%)，P ＜0.01，圖2A］。孟魯司特 0.2 ～10 μmol/L 預(yù)先孵育PC12細(xì)胞30 min，再用3 μmol/L魚藤酮處理24 h，結(jié)果表明1、5 μmol/L 孟魯司特可顯著抑制魚藤酮誘導(dǎo)的細(xì)胞活性降低［100.0±2.9 vs 103.7 ± 3.1、98.8 ± 4.3(%)］，而 0.2、10 μmol/L孟魯司特?zé)o顯著抑制作用［100.0±2.9 vs 90.9 ± 2.8、77.1 ± 4.5(%)，P ＜ 0.05 ～0.01，圖 2B］。

2.3 魚藤酮引起PC12細(xì)胞CysLT1受體表達(dá)的變化 Western blotting檢測(cè)結(jié)果表明，PC12細(xì)胞在正常條件下表達(dá)CysLT1受體(條帶約43 kD，圖 3A);魚藤酮 1、3、10 μmol/L 處理 24 h后，PC12細(xì)胞表達(dá)CysLT1受體表達(dá)顯著增加［100 ± 4.4 vs 135.7 ± 6.3、146.9 ± 5.8、118.1±5.5(與 GAPDH 的比值)，P ＜0.05，圖 3A］。魚藤酮3 μmol/L 作用3、24 h 后，CysLT1受體表達(dá)顯著增多［100 ±4.2 vs 155.4 ±5.6，153.3 ±5.7(與 GAPDH 的比值)，P ＜0.05，圖3B］。

2.4 魚藤酮誘導(dǎo)PC12細(xì)胞CysLT1受體分布的改變 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CysLT1受體正常情況下主要分布在細(xì)胞核;經(jīng)0.003 μmol/L魚藤酮處理24 h后CysLT1受體分布未發(fā)生明顯變化，但 0.01 μmol/L 以上魚藤酮處理 24 h后，CysLT1受體趨向分布于胞漿(圖 4A)，當(dāng) 3 μmol/L魚藤酮處理從25 min開(kāi)始，CysLT1受體分布發(fā)生變化(圖4B)。

3 討論

本研究結(jié)果表明，魚藤酮0.3～30 μmol/L處理24 h，可濃度依賴性降低PC12細(xì)胞活性，并改變細(xì)胞形態(tài)。CysLT1受體拮抗劑孟魯司特對(duì)魚藤酮誘導(dǎo)損傷的保護(hù)作用，提示CysLT1受體可能參與PC12細(xì)胞的PD樣變化。孟魯司特的作用表現(xiàn)“鐘形”量效關(guān)系，即1、5 μmol/L能有效減輕細(xì)胞損傷，而 0.2、10 μmol/L 則無(wú)明顯減輕作用，這一結(jié)果與腦缺血整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果［14］相似。

CysLT1受體表達(dá)、分布特點(diǎn)進(jìn)一步證實(shí)其與魚藤酮損傷的關(guān)系。魚藤酮1～10 μmol/L作用 24 h后，CysLT1受體顯著增加，但 30 μmol/L未顯示該作用。鑒于魚藤酮慢性中毒誘導(dǎo)PD病變時(shí)能到達(dá)腦內(nèi)的濃度可能較低，因此，CysLT1受體可能在PD發(fā)生中起調(diào)節(jié)作用。魚藤酮3 μmol/L誘導(dǎo)CysLT1受體表達(dá)的時(shí)間過(guò)程具有“雙峰”特點(diǎn)，即在3 h及24 h存在表達(dá)高峰，提示CysLT1受體可能介導(dǎo)急性和后期效應(yīng)。在大鼠局灶性腦缺血后，缺血中心區(qū)在3～12 h及7～14 d也有2個(gè)CysLT1受體表達(dá)高峰，分別介導(dǎo)急性神經(jīng)元損傷和后期小膠質(zhì)細(xì)胞激活［10］。在本實(shí)驗(yàn)離體條件下，很可能由于魚藤酮誘導(dǎo)早期代謝障礙，促進(jìn)CysLT1受體表達(dá)并介導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷;而后期(24 h)由于細(xì)胞因子等釋放促進(jìn)CysLT1受體表達(dá)，參與炎癥相關(guān)的變化。這一雙峰表達(dá)的機(jī)制和意義，還有待闡明。

免疫組化結(jié)果證實(shí)，正常情況下 CysLT1受體主要分布于PC12細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)，隨魚藤酮作用濃度的升高，CysLT1受體移位到胞漿;3 μmol/L魚藤酮作用的時(shí)間過(guò)程表明，從25 min開(kāi)始，CysLT1受體就發(fā)生明顯的移位。在結(jié)腸癌細(xì)胞中，CysLT1受體也主要分布在核內(nèi)［17］，其意義尚未闡明，但認(rèn)為與細(xì)胞增殖反應(yīng)有關(guān)［17］。在 BV2 細(xì)胞，魚藤酮濃度依賴性誘導(dǎo)CysLT1受體核移位［9］，可能與小膠質(zhì)細(xì)胞激活相關(guān);但魚藤酮對(duì)PC12細(xì)胞表現(xiàn)損傷作用，其誘導(dǎo)的CysLT1受體移位特點(diǎn)有別于BV2細(xì)胞。CysLT1受體的這種移位特點(diǎn)，與PC12細(xì)胞損傷究竟有什么關(guān)聯(lián)，還需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究證明CysLT1受體參與魚藤酮誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷，CysLT1受體拮抗劑孟魯司特可減輕魚藤酮誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，其機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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