Rpe65在2型糖尿病模型大鼠視網(wǎng)膜病變中的表達(dá)研究

謝 勝 梅 妍

（昆明醫(yī)學(xué)院附屬昆華醫(yī)院，云南省第一人民醫(yī)院，昆明 650032）

糖尿病視網(wǎng)膜病變（Diabetic retinopathy，DR）是糖尿病最常見最嚴(yán)重的慢性并發(fā)癥之一，極具視力威脅。DR 是一種多因素的復(fù)雜疾病，其發(fā)病機(jī)制經(jīng)過多年的研究尚未完全明確，近年研究發(fā)現(xiàn)光感受器功能相關(guān)基因在糖尿病視網(wǎng)膜病變過程中有所表達(dá)，其中色素上皮細(xì)胞特異蛋白65（Retina pigment epithelia－specific protein 65，RPE65）突變可導(dǎo)致視網(wǎng)膜中視紫紅質(zhì)含量降低，相當(dāng)于視網(wǎng)膜長(zhǎng)時(shí)間處于暗環(huán)境中［1－4］，從而造成光感受器細(xì)胞不能對(duì)光發(fā)生反應(yīng)，到疾病晚期發(fā)生視錐和視桿細(xì)胞變性導(dǎo)致嚴(yán)重的視力喪失。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)Rpe65 敲除小鼠在生后2～3周即可出現(xiàn)視錐細(xì)胞變性，且隨著年齡的增加視桿細(xì)胞也逐漸發(fā)生變性［5］。這種視網(wǎng)膜光損傷的易感性是由基因決定的，而Rpe65在其中起重要作用［6］。我們采用實(shí)時(shí)熒光定量多聚酶鏈反應(yīng)（RT－PCR）技術(shù)，初步分析Rpe65在不同病程糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織上的表達(dá)量。

1 材料與方法

1.1 糖尿病動(dòng)物模型

SD 大鼠32只，雌性，體重：56～460g（昆明醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供）。SPF 級(jí)GK2 型糖尿病大鼠32只，雌性，體重：98～442g（上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）。動(dòng)物按標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)動(dòng)物要求飼養(yǎng)。按糖尿病病程分為四組，即糖尿病4w 組、8w 組、16w組、24w 組，每組8只。對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組周齡相對(duì)應(yīng)分組，每組8只。

1.2 視網(wǎng)膜總RNA提取及純度檢測(cè)

取對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組各32只大鼠，血糖值范圍分別為5.2～6.7mmol／L（均值5.8mmol／L）和11.8～22.3mmol／L（均值17.9 mmol／L）。3%戊巴比妥按2ml／kg體重腹腔注射深麻醉后取視網(wǎng)膜。用TRIZOL試劑盒，按說明書進(jìn)行操作提取總RNA。4%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度儀檢測(cè)結(jié)果顯示RNA 含量及純度達(dá)到試驗(yàn)要求。

1.3 RT－PCR

分別取正常組、實(shí)驗(yàn)組樣本總RNA 各1ml，設(shè)計(jì)引物序列Rpe65F和Rpe65R 分別為5′－actgtcctcaccactaac－3′和5′－aggctcagatccaacttc－3′（分子量為106BP），GAPDHF 和GAPDHR 分別為5′－gtgacttcaacagcaactc－3′和5′－gtccagggtttcttactcc－3′，由上海生工公司合成引物。由此逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，并進(jìn)行RT－PCR測(cè)定。擴(kuò)增反應(yīng)完畢后根據(jù)融解曲線分析PCR 產(chǎn)物的特異性，由Light Cycler PCR 儀分析其Ct值，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較得到定量結(jié)果。采用相對(duì)雙Delta Ct法（DDCT／2－ΔΔCT）進(jìn)行結(jié)果分析，公式：2－ΔΔCT。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組測(cè)量指標(biāo)的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或配對(duì)樣本的t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

Rpe65和GAPDH 溶解曲線呈單一峰值，特異性較好，結(jié)果可靠；Rpe65和GAPDH 擴(kuò)增曲線呈S型，擴(kuò)增效果良好。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間的平均Ct值具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見表1）。結(jié)果表明：RT－PCR 檢測(cè)視網(wǎng)膜內(nèi)Rpe65的表達(dá)，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中Rpe65 的表達(dá)隨周齡的增加呈下降趨勢(shì)，即4W＞8W＞16W＞24W。

表1 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組各周齡大鼠的Rpe6表達(dá)的定量PCR結(jié)果Table 1 The level of Rpe6expression of different aged rats in control and experiment groups

3 討論

Rpe65由Hamel等于1993 年發(fā)現(xiàn)，定位于染色體1p31，是視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞特異性表達(dá)、高度保守的蛋白序列。在視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中大量特異性表達(dá)，尤其以視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞微粒體膜表達(dá)為主。其含有14 個(gè)外顯子，編碼533 個(gè)氨基酸，分子量為65KD，被認(rèn)為是催化全－反－視黃酯轉(zhuǎn)變成11－順－視黃醇的異構(gòu)酶之一，后者再經(jīng)過一系列代謝轉(zhuǎn)變成視紫紅質(zhì)，參與光信號(hào)的傳導(dǎo)過程［7］。

通常認(rèn)為糖尿病視網(wǎng)膜病變主要是視網(wǎng)膜微血管病變。然而，越來越多的證據(jù)表明，糖尿病視網(wǎng)膜病變出現(xiàn)微血管病變以前，神經(jīng)視網(wǎng)膜已有病變改變，即視功能損害早于微血管病變發(fā)生。研究顯示，早期糖尿病患者視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和雙極細(xì)胞功能就已有異常改變［8］。在眼底血管出現(xiàn)熒光造影異常前就表現(xiàn)出視覺電生理、色覺和視野檢查的異常［9－10］。Kirwin等［11］應(yīng)用PCR和免疫組化實(shí)驗(yàn)技術(shù)顯示，Rpe65在糖尿病4周時(shí)表達(dá)降低，并隨病程持續(xù)下降至3個(gè)月后，證明在糖尿病早期，神經(jīng)膠質(zhì)和神經(jīng)元功能障礙已導(dǎo)致視覺損害。梅妍等［12］實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，糖尿病早期，代謝的異常已經(jīng)對(duì)視網(wǎng)膜光感受器的功能產(chǎn)生了影響。光感受器功能相關(guān)基因的表達(dá)異常有可能是糖尿病早期微血管病變發(fā)生前視力下降、色覺喪失、對(duì)比敏感度降低和視網(wǎng)膜電流圖異常的重要原因。電生理研究提示，早期糖尿病患者視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞功能就已有異常改變。形態(tài)學(xué)研究究也提示，神經(jīng)視網(wǎng)膜變性先于微血管損害發(fā)生［13－14］。

本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)2 型糖尿病大鼠不同病程中Rpe65的表達(dá)量，探討其在2型糖尿病視網(wǎng)膜病變過程中的作用。結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組相比，糖尿病組各期Rpe65表達(dá)下降，且隨著病程的延長(zhǎng)，表達(dá)逐漸降低。表明Rpe65 表達(dá)變化與DR 發(fā)生有關(guān)，其在視網(wǎng)膜上的表達(dá)水平與2型糖尿病模型大鼠的病程呈負(fù)相關(guān)性。提示糖尿病影響了Rpe65在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜上的表達(dá)，這種表達(dá)的改變可能參與了糖尿視網(wǎng)膜病變的發(fā)生，并且這種表達(dá)的改變有可能是糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)生發(fā)展的促進(jìn)因素之一，對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變并非僅是微血管病變的觀點(diǎn)起到了一些支持作用，也為進(jìn)一步探索預(yù)防早期糖尿病視網(wǎng)膜病變的進(jìn)展和開辟治療糖尿病視網(wǎng)膜病變的新途徑提供了一些新的線索。

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