超臨界CO2綠色萃取人參皂苷Rh1、人參皂苷Rh2的研究

姜曉晴，魏福祥，張 楠，姜旭萍，許 嬪，張尚正

（河北科技大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊 050018）

人參為五加科植物人參（Panax ginseng C.A.Meyer）的干燥根，作為珍貴藥材，具有大補(bǔ)元?dú)狻?fù)脈固脫、補(bǔ)脾益肺之功能［1］。西洋參葉為五加科植物，其主要有效成分為人參皂苷，由于其在抗腫瘤方面毒性較低，具有顯著提高機(jī)體免疫功能，因而日益受到人們的關(guān)注。人參皂苷Rh1為20（S）-原人參三醇型皂苷［2］，具有極高的生理活性，在抑制癌細(xì)胞增殖、抗腫瘤等方面體現(xiàn)了良好的藥效［3］，因而獲得人參皂苷Rh1單體對深入研究其藥理作用具有重要意義。人參皂苷Rh2具有誘導(dǎo)癌細(xì)胞分化逆轉(zhuǎn)作用，對多種癌細(xì)胞的增殖具有直接抑制作用［4］。

人參皂苷的提取主要分為物理、化學(xué)方法［5-7］（酸解法、堿解法、半合成法）和生物方法［8-11］（酶解法、微生物代謝法）。采用超臨界CO2萃取人參皂苷的報(bào)道有很多，但是將超臨界CO2萃取技術(shù)應(yīng)用到人參皂苷Rh1、人參皂苷Rh2的萃取中的研究較少。超臨界萃取技術(shù)作為綠色、環(huán)境友好的技術(shù)被廣泛地應(yīng)用于食品［12］、制藥［13-14］、化工、環(huán)境等領(lǐng)域。筆者采用超臨界CO2萃取技術(shù)提取西洋參中的人參皂苷Rh1、人參皂苷Rh2，不但得率較高，而且一次性提取量大，有利于工業(yè)生產(chǎn)。該技術(shù)是一種綠色環(huán)保的新型技術(shù)，能夠緩解工業(yè)生產(chǎn)對環(huán)境造成的壓力。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與設(shè)備

HA221-50-60超臨界CO2萃取裝置（江蘇華安公司提供）；高效液相色譜儀（日本島津公司提供）；電子天平（上海良平儀器儀表有限公司提供）。

1.2 材料與試劑

人參總次苷原料（某中藥研究所提供）；人參皂苷Rh1、人參皂苷Rh2標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品檢定所提供）。

乙腈（用作流動(dòng)相，色譜純，體積分?jǐn)?shù)為99.9%，天津市康科德科技有限公司提供）；二次蒸餾水；磷酸（分析純，天津市永大化學(xué)試劑廠提供）；甲醇、乙醇、乙酸乙酯（色譜純，天津市永大化學(xué)試劑廠提供）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 人參皂苷Rh1、人參皂苷Rh2的萃取

準(zhǔn)確稱取人參總次苷100g放入物料袋中并向其中注入適量夾帶劑（乙酸乙酯），封口，放入萃取釜中。將萃取釜安裝到超臨界設(shè)備，在夾帶劑罐中加入所需體積的夾帶劑，設(shè)定壓力、溫度，通入CO2，啟動(dòng)設(shè)備，用試劑瓶在出口處收集萃出物。

1.3.2 人參總次苷原料的測定

稱取一定量的人參總次苷原料，用甲醇溶解配制成質(zhì)量濃度為0.5mg／mL的溶液，注入液相色譜儀中測定，得原料中人參皂苷Rh1的含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）為24.24%，人參皂苷Rh2的含量為13.76%，人參總次苷原料液相色譜圖見圖1。

1.3.3 人參皂苷Rh1、人參皂苷Rh2的測定

1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

采用高效液相色譜法測定人參皂苷Rh1、人參皂苷Rh2。分別精確稱取人參皂苷Rh1標(biāo)準(zhǔn)品、人參皂苷Rh2標(biāo)準(zhǔn)品6mg于10mL容量瓶中，用甲醇溶解、定容、搖勻，得0.6mg／mL的人參皂苷Rh1標(biāo)準(zhǔn)溶液、0.6mg／mL人參皂苷Rh2標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液1，2，4，6，8，10μL注入液相色譜儀測定，測定結(jié)果以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到人參皂苷Rh1的回歸方程為Y=44 427X-3 930.9，R=0.999 6；人參皂苷Rh2的回歸方程為Y=451 322X-837.94，R=0.999 7。

圖1 人參總次苷原料液相色譜圖Fig.1 HPLC spectra of total saponins

2）樣品的測定

精確量取萃取物1mL，用甲醇定容至10mL，吸取10μL注入高效液相色譜儀中，測定，并計(jì)算人參皂苷Rh1、人參皂苷Rh2的得率。

2 結(jié)果與討論

2.1 夾帶劑的選擇

夾帶劑是在純超臨界流體中加入的一種少量的、可以與之混溶的、具有揮發(fā)性的、介于被分離物質(zhì)與超臨界組分之間的某一種或多種物質(zhì)的混合物［15］。目前常用的夾帶劑有醇類、丙酮、乙酸乙酯等極性物質(zhì)［16］。

本研究在萃取溫度為45℃、萃取壓力為30MPa、萃取時(shí)間為3h的條件下，分別用甲醇、乙醇（體積分?jǐn)?shù)為95%）和乙酸乙酯作夾帶劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測定人參皂苷Rh1和人參皂苷Rh2的得率。結(jié)果見表1。由表1可知，用乙酸乙酯作為夾帶劑時(shí)人參皂苷Rh1和人參皂苷Rh2的得率最高，因此選用乙酸乙酯作為夾帶劑。

在前述相同條件下，分別用100，200，300，400，500mL乙酸乙酯作夾帶劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示?？梢钥闯?，在夾帶劑的量小于300mL時(shí)人參皂苷Rh1、人參皂苷Rh2的得率隨夾帶劑用量的增加而逐漸增加；當(dāng)夾帶劑的量大于300mL時(shí)，人參皂苷的得率基本不變，所以選擇300mL乙酸乙酯作夾帶劑。

在45℃，30MPa及提取時(shí)間為3h的條件下，用300mL乙酸乙酯作動(dòng)態(tài)或靜態(tài)夾帶劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測定其提取物中Rh1和Rh2的含量。結(jié)果見表2。

表1 夾帶劑種類的影響Tab.1 Effect of cosolvent sort

表2 夾帶劑的加入方式的影響Tab.2 Effect of cosolvent join way

圖2 夾帶劑用量的影響Fig.2 Effect of cosolvent volume

由表2可知，用10mL乙酸乙酯作固態(tài)夾帶劑、290mL乙酸乙酯作動(dòng)態(tài)夾帶劑時(shí)的得率明顯高于300mL乙酸乙酯全部作動(dòng)態(tài)夾帶劑時(shí)的得率，所以選擇10mL乙酸乙酯作固態(tài)夾帶劑，290 mL乙酸乙酯作動(dòng)態(tài)夾帶劑。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 溫度對人參皂苷得率的影響

在溫度分別為25，35，45，55，65℃，壓力為30MPa，萃取3h，用10mL乙酸乙酯作固態(tài)夾帶劑，290mL乙酸乙酯作動(dòng)態(tài)夾帶劑的條件下，進(jìn)行人參皂苷提取實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。

由圖3可知，人參皂苷Rh1、人參皂苷Rh2的得率隨萃取溫度的升高先增大后減小，萃取溫度為45℃時(shí)，兩者的得率最高，所以萃取溫度選擇45℃。

2.2.2 壓力對人參皂苷得率的影響

在壓力分別為10，20，30，40，50MPa，溫度45℃，萃取3h，用10mL乙酸乙酯作固態(tài)夾帶劑，290mL乙酸乙酯作動(dòng)態(tài)夾帶劑的條件下，進(jìn)行人參皂苷提取的實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4。

圖3 萃取溫度對人參皂苷得率的影響Fig.3 Effect of temperature on ginsenoside extraction rate

圖4 萃取壓力對人參皂苷得率的影響Fig.4 Effect of pressure on ginsenoside extraction rate

由圖4可知，當(dāng)壓力小于20MPa、大于40MPa時(shí)，人參皂苷的得率明顯偏低；人參皂苷Rh1、人參皂苷Rh2的得率隨萃取壓力的升高先增大后減小，在30MPa時(shí)達(dá)到最高，所以萃取壓力選擇30MPa。

2.2.3 萃取時(shí)間對人參皂苷得率的影響

在萃取時(shí)間分別為1，2，3，4，5h，溫度為45℃，壓力為30MPa，以10mL乙酸乙酯作固態(tài)夾帶劑，290 mL乙酸乙酯作動(dòng)態(tài)夾帶劑的條件下，進(jìn)行人參皂苷提取的實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5。

由圖5可知，當(dāng)萃取時(shí)間小于2h、大于4h時(shí)，人參皂苷的得率急劇降低；萃取時(shí)間為3h時(shí)，人參皂苷的得率較高，因此選擇萃取時(shí)間為3h。

2.3 正交試驗(yàn)

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定了以10mL乙酸乙酯作固態(tài)夾帶劑，290mL乙酸乙酯作動(dòng)態(tài)夾帶劑，為優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，對溫度、壓力、萃取時(shí)間做三因素三水平的正交試驗(yàn)，因素水平安排見表3，結(jié)果與分析見表4和表5。

表3 各因素及水平選擇Tab.3 Affecting factors and levels

圖5 萃取時(shí)間對人參皂苷得率的影響Fig.5 Effect of extraction time on ginsenoside extraction rate

表4 人參皂苷Rh1正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.4 Scheme and experimental results of orthogonal array design of ginsenoside Rh1

表5 人參皂苷Rh2正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析Tab.5 Scheme and experimental results of orthogonal array design of ginsenoside Rh2

由正交試驗(yàn)可以得出，各因素對人參皂苷Rh1得率的影響順序?yàn)闇囟龋据腿r(shí)間＞壓力；提取的最優(yōu)方案為A2B2C2，即萃取溫度為45℃、萃取壓力為30MPa、萃取時(shí)間為3h的條件下人參皂苷Rh1的得率最高。

由正交試驗(yàn)可以得出，各因素對人參皂苷Rh2得率的影響順序?yàn)闇囟龋緣毫Γ据腿r(shí)間；得到最優(yōu)方案為A2B2C2。

結(jié)合人參皂苷Rh1、人參皂苷Rh2的正交試驗(yàn)結(jié)果，得到萃取的最佳條件：萃取溫度為45℃、萃取壓力為30MPa、萃取時(shí)間為3h。萃取產(chǎn)物液相圖譜見圖6。

3 結(jié) 論

選用10mL乙酸乙酯作固態(tài)夾帶劑，290mL乙酸乙酯作動(dòng)態(tài)夾帶劑，綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最終確定超臨界CO2提取人參皂苷Rh1和人參皂苷Rh2的條件：萃取溫度為45℃、萃取壓力為30MPa、萃取時(shí)間為3h，10mL乙酸乙酯作固態(tài)夾帶劑、290mL乙酸乙酯作動(dòng)態(tài)夾帶劑。在此最佳條件下，人參皂苷Rh1和人參皂苷Rh2的得率分別為7.33%，14.69%。采用超臨界CO2萃取人參皂苷Rh1、人參皂苷Rh2，方法簡便，制取過程綠色環(huán)保，污染小，收率較高。

圖6 萃取產(chǎn)物液相色譜圖Fig.6 HPLC spectra of products

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