單胚胎RT-qPCR對(duì)豬體細(xì)胞核移植囊胚全能性的分析

吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院 謝萬華 陳仙菊 姚朝剛 韓 陽(yáng) 逄大欣 唐曉春

體細(xì)胞核移植技術(shù)現(xiàn)已成功應(yīng)用到牛、小鼠、豬、兔和狗等多種哺乳動(dòng)物，其在生物醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)研究等領(lǐng)域具有較大價(jià)值。然而，體細(xì)胞核移植技術(shù)存在克隆效率低下，大量的克隆動(dòng)物出生后就死亡，或者各種器官發(fā)育不正常等問題。有研究認(rèn)為，克隆動(dòng)物發(fā)育不正常主要是供體細(xì)胞核重編程不完全導(dǎo)致的 （Hochedlinger和Jaenisch，2003）。處于分化狀態(tài)的供體細(xì)胞核需要通過卵母細(xì)胞中一些重編程因子的作用將其轉(zhuǎn)化為胚胎的去分化狀態(tài)才能繼續(xù)發(fā)育。目前關(guān)于重編程的機(jī)制了解甚少。研究發(fā)現(xiàn)，重編程因子是通過調(diào)控一些關(guān)鍵基因的表達(dá)從而維持正常的發(fā)育（Tamashiro等，2002）。因此，通過對(duì)胚胎發(fā)育中關(guān)鍵基因的研究，可以揭示發(fā)育的機(jī)制。然而，胚胎間的發(fā)育是相對(duì)獨(dú)立的過程，即使在同一母體內(nèi)，受精卵的發(fā)育也不是同步進(jìn)行的，各個(gè)胚胎中基因的表達(dá)存在很大差異。而傳統(tǒng)的基因表達(dá)研究方法需要從大量的樣品中獲取模板，極大的限制了其對(duì)微量樣品的研究，如胚胎的發(fā)育。因此，有必要從單胚胎水平來研究胚胎的發(fā)育（Stahlberg等，2011；Wang 和 Bodovitz，2010）。 本試驗(yàn)從單胚胎水平，分析了豬體細(xì)胞核移植囊胚和體內(nèi)囊胚中全能性基因（Oct4、Nanog和 Sox2）的表達(dá)量，同時(shí)還比較了這兩種囊胚的質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 豬卵巢和動(dòng)物 豬卵巢采自長(zhǎng)春市綠園區(qū)屠宰場(chǎng)。試驗(yàn)動(dòng)物為懷孕33～35 d的長(zhǎng)白母豬和人工授精5 d的長(zhǎng)白母豬，均來自吉林大學(xué)種豬場(chǎng)。

1.1.2 主要試劑 Nonidet P-40購(gòu)于Amresco公司；SUPERase-In RNA酶抑制劑購(gòu)于Applied Biosystems公司；SuperScriptⅢ 反轉(zhuǎn)錄酶、5×First-Strand Buffer、DTT均購(gòu)于 Invitrogen公司；RiboLock RNA酶抑制劑、去RNA酶水均購(gòu)于Fermentas公司；T4噬菌體基因32編碼蛋白購(gòu)于New England Biolabs公司；SYBR GreenⅠ熒光PCR試劑盒購(gòu)于杭州博日科技有限公司。

1.1.3 主要器材 體視顯微鏡、顯微操作儀、倒置熒光顯微鏡購(gòu)于日本Nikon公司；超凈工作臺(tái)、4℃恒溫離心機(jī)、CO2培養(yǎng)箱購(gòu)于美國(guó)Thermo公司；BTX 2000電細(xì)胞融合儀購(gòu)于美國(guó)BTX公司。

1.2 方法

1.2.1 卵母細(xì)胞的采集與體外成熟 從屠宰場(chǎng)采集豬卵巢，放于有青霉素和鏈霉素的生理鹽水中，以35℃恒溫運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。用12號(hào)無菌注射器抽取直徑為3～6 mm卵泡中的卵母細(xì)胞。在體視顯微鏡下迅速挑取包含有3層以上卵丘細(xì)胞、致密、胞質(zhì)均勻的卵母細(xì)胞，用TL-HEPES-PVA液洗滌3次，再用豬卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液洗滌3次后放于成熟液中，于38.5℃，5%CO2的飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（Lai和 Prather，2003）。

1.2.2 供體細(xì)胞的制備 通過手術(shù)獲取懷孕33～35 d的長(zhǎng)白豬胎兒，用剪刀、鑷子去胎兒頭、尾、四肢和內(nèi)臟，其余部分用剪刀剪碎，然后用膠原蛋白酶消化組織。用含20%FBS的DMEM培養(yǎng)液原代培養(yǎng)。0.25%胰蛋白酶消化成單細(xì)胞后，用含10%FBS的DMEM傳代培養(yǎng)。核移植使用前，將細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化成單個(gè)細(xì)胞懸液。

1.2.3 重構(gòu)胚的構(gòu)建 將體外成熟42～44 h的卵母細(xì)胞用透明質(zhì)酸酶處理，去除顆粒細(xì)胞。在體式顯微鏡下挑取排除第一極體的成熟卵母細(xì)胞，用操作液洗滌 3次（Lai和 Prather，2003）。 核移植在含7.5 μg/mL細(xì)胞松弛素B的操作液中進(jìn)行。將卵母細(xì)胞第一極體調(diào)到5點(diǎn)鐘方向，用內(nèi)徑為20 μm的注射針從卵母細(xì)胞3點(diǎn)鐘方向刺入，吸出第一極體及其附近的胞質(zhì)，從而去核；吸取一個(gè)成纖維細(xì)胞從原來的口將其注入透明帶與卵母細(xì)胞膜間的卵周隙中。

1.2.4 重構(gòu)胚的融合與激活 重構(gòu)胚的融合和激活在BTX 2000電細(xì)胞融合儀作用下完成。將重構(gòu)胚胎放于盛有融合液的電極槽的兩電極之間（Lai和 Prather，2003）。 然后進(jìn)行 1.2 kV/cm，30 μs，2次直流電脈沖使供體細(xì)胞與卵母細(xì)胞融合，同時(shí)激活卵母細(xì)胞。激活的重構(gòu)用PZM-3洗滌3次，放于PZM-3中，于38.5℃，5%CO2的飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.5 體內(nèi)囊胚的獲取 對(duì)發(fā)情的長(zhǎng)白豬進(jìn)行人工授精。授精后第5天，通過手術(shù)的方法，用含10%FBS的PBS從母豬子宮中沖取囊胚，并且保存于38.5℃條件下，盡快運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，用PZM-3洗滌3次，保存于38.5℃，5%CO2的飽和濕度的培養(yǎng)箱中，備用（Lai和 Prather，2003）。

1.2.6 囊胚質(zhì)量檢測(cè) 高倍鏡下觀察體內(nèi)囊胚和克隆囊胚形態(tài)學(xué)上的差異。囊胚細(xì)胞數(shù)目的檢測(cè)：用4%多聚甲醛固定囊胚，然后用Hoechest 33342定位細(xì)胞核，在紫外激發(fā)下用熒光顯微鏡觀測(cè)并記錄這兩種囊胚的細(xì)胞數(shù)目。

1.2.7 單囊胚cDNA的制備 參考單細(xì)胞RNASeq方法，建立單胚胎cDNA制備的方法。囊胚用臺(tái)氏液去掉透明帶，用口吸管將去透明帶的囊胚放于含0.1 mg/mL BSA的PBS液滴中洗滌3次（Tang 等，2010、2009）。 再將囊胚轉(zhuǎn)移入 22.25 μL的細(xì)胞裂解液中，細(xì)胞裂解液在使用前配制，體系為：5 μL 5× First-Strand Buffer，1.125 μL 10%Nonidet P-40，1.125 μL DTT （0.1 mol/L），0.225 μL SUPERase-In RNA 酶抑制劑，0.225 μL RiboLockTM RNA酶抑制劑，0.625 μL引物 Oligo（dT）（0.5 μmol/L），0.45 μL dNTP，13.225 μL 去RNA酶水。引物Oligo（dT）序列為：5’-ATATGGATCCGGCGCGCCGTCGACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’。然后將裂解的細(xì)胞樣品于70℃水浴處理90 s，立刻放于冰上冰浴，使RNA從細(xì)胞中釋放出來。向樣品中加入2.25 μL的反轉(zhuǎn)錄酶混合體系（1.65 μL SuperScripⅢ 反轉(zhuǎn)錄酶，0.25 μL RiboLockTM RNA酶抑制劑，0.35 μL T4噬菌體基因32編碼蛋白）。50℃水浴反應(yīng)30 min，70℃酶滅活處理15 min。將合成的cDNA保存于-20℃。

1.2.8 qPCR引物的設(shè)計(jì)及其擴(kuò)增效率的鑒定qPCR引物采用Beacon Designer 7軟件設(shè)計(jì)。引物序列分別為，β-actin上游引物：GAACCCCAAAGCCAACCGT，下游引物 ：CCTCGTAGATGGGCACCGT，退火溫度為60℃，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為 173 bp；Oct4上游引物：AAGCAGTGACTATTCGCAAC，下游引物：CAGGGTGGTGAAGTGAGG，退火溫度為60℃，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為136 bp；Nanog 上游引物：TCCTCTTCCTTCCTCCAT，下游引物：TCCTTCTCTGTGCTCTTC，退火溫度為54℃，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為 108 bp；Sox2上游引物：CGCAGACCTACATGAACG， 下游引物：TCGGACTTGACCACTGAG，退火溫度為60℃，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為103 bp。用制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法檢測(cè)引物的擴(kuò)增效率。以制得的8 μL體內(nèi)囊胚cDNA為初始模板，2倍梯度稀釋制備5～6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品，然后用這些標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。從儀器自動(dòng)獲取標(biāo)準(zhǔn)曲線和擴(kuò)增效率。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 反應(yīng)體系：12.5 μL 2×SYBR Green master mix，8 μL cDNA，1 μL 上下游引物 （各 0.5 μL），3.35 μL ddH2O，0.15 μL Taq DNA 聚合酶；94 ℃ 2 min，94 ℃ 10 s，退火 30 s，72 ℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)。

1.2.9 實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)囊胚的全能性基因 分別以制備的5個(gè)體細(xì)胞核移植囊胚和5個(gè)體內(nèi)囊胚的cDNA為模板，用iQ 5實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)以 SYBR Green I為熒光染料檢測(cè) Oct4、Nanog和Sox2的表達(dá)量。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體 系 ：12.5 μL 2×SYBR Green master mix，2 μL cDNA，1 μL 上下游引 物 （各 0.5 μL），3.35 μL ddH2O，0.15 μL Taq DNA 聚合酶；94 ℃ 2 min，94℃ 10 s，退火 30 s，72 ℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)。 采用相對(duì)定量方案，以2-△△Ct方法分析數(shù)據(jù) （Livak和Schmittgen，2001）。β-actin 作為參照基因，以體內(nèi)1號(hào)囊胚為參照組。用SPSS16.0軟件分析數(shù)據(jù)的差異性，當(dāng)P值小于0.05時(shí)認(rèn)為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬體細(xì)胞核移植囊胚質(zhì)量的檢測(cè) 在高倍顯微鏡下，對(duì)豬體細(xì)胞核移植囊胚和體內(nèi)囊胚細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行比較。在Hoechest 33342染料作用下，記錄了10個(gè)克隆囊胚和10個(gè)體內(nèi)囊胚的細(xì)胞數(shù)目，分別為110±10.3和54±12.6。體細(xì)胞核移植囊胚中細(xì)胞總數(shù)顯著降低（P<0.05）。相比體內(nèi)囊胚，體細(xì)胞核移植囊胚的細(xì)胞形態(tài)差，無明顯的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)集落。

2.2 引物擴(kuò)增效率 由圖1可見，引物β-actin、Oct4、Sox2和Nanog的擴(kuò)增效率 （E值）分別為99.5%、104.5%、98.3%和96.1%，PCR擴(kuò)增效率為 95%～105%，相關(guān)系數(shù)（r2）>0.98，可用于實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)對(duì)應(yīng)基因的表達(dá)。

2.3 豬體細(xì)胞核移植囊胚和體內(nèi)囊胚全能性基因表達(dá)水平的比較 由圖2可見，Nanog和Sox2的表達(dá)量在5個(gè)體細(xì)胞核移植囊胚中均顯著低于體內(nèi)囊胚；除了體內(nèi)2號(hào)囊胚的Oct4表達(dá)量和4個(gè)核移植囊胚差異不顯著外，其余4個(gè)體內(nèi)囊胚中的Oct4表達(dá)量均顯著高于5個(gè)體細(xì)胞核移植囊胚（P<0.05）。

3 討論

本試驗(yàn)中，通過與體內(nèi)囊胚比較，發(fā)現(xiàn)體細(xì)胞核移植囊胚的細(xì)胞不但形態(tài)差，而且囊胚中細(xì)胞的數(shù)目顯著降低。研究表明，細(xì)胞的增殖和分化與細(xì)胞凋亡相關(guān)（Exley等，1999），并且體細(xì)胞核移植囊胚的細(xì)胞凋亡率顯著高于體外受精囊胚和體內(nèi)囊胚（Yu等，2007）。因此，本試驗(yàn)中體外培養(yǎng)的核移植囊胚細(xì)胞數(shù)的減少可能是由細(xì)胞凋亡導(dǎo)致。

為了正常的發(fā)育，在體細(xì)胞核移植中，已經(jīng)分化的供體必須通過重編程的過程適當(dāng)?shù)募せ钅承┗蚝完P(guān)閉某些分化基因的表達(dá)以支持胚胎的發(fā)育 （Humpherys等，2002）。在早期胚胎發(fā)育過程中，Oct4、Nanog和Sox2對(duì)維持胚胎的全能性是必須的（Bortvin 等，2003；Boiani等，2002）。 有報(bào)道證實(shí)，敲除Oct4的小鼠囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)缺失全能性。Oct4與Sox2相互作用可以與Nanog基因啟動(dòng)子結(jié)合，從而調(diào)控Nanog的表達(dá)，三者通過網(wǎng)絡(luò)調(diào)控細(xì)胞的全能性 （Rodda等，2005；Nichols等，1998）。本試驗(yàn)通過建立單胚胎RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)豬體細(xì)胞核移植囊胚和體內(nèi)囊胚中全能性基因（Oct4、Nanog和Sox2）的表達(dá)量。與體內(nèi)囊胚相比，體細(xì)胞核移植囊胚中全能性基因的表達(dá)量普遍下降。分析認(rèn)為，豬體細(xì)胞核移植囊胚質(zhì)量差與其全能性基因（Oct4、Nanog和Sox2）表達(dá)量低相關(guān)。

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