聰智靈對擬血管性癡呆小鼠海馬乙酰膽堿酯酶的影響*

河北醫(yī)科大學中醫(yī)學院(石家莊050091)

張會珍 白亞平△ 肖紅玲 王鑫國 張 闖△△ 孫彥輝 吳中秋

血管性癡呆 (VD)是因腦血管因素所致的智能及認知功能障礙臨床綜合征。近年來，隨著老齡人口不斷增加，VD發(fā)病率呈現(xiàn)增高趨勢。VD的發(fā)病機制目前尚未完全探明，現(xiàn)代醫(yī)學尚缺乏系統(tǒng)有效的治療手段，臨床對VD的防治多屬于對癥治療，［1］而中醫(yī)藥在防治腦血管病方面的優(yōu)勢已得到臨床驗證。本研究通過復制腦缺血再灌注VD小鼠模型，觀察中藥復方聰智靈對VD模型小鼠學習記憶能力及海馬組織乙酰膽堿酯酶 (AchE)活力的影響，探討聰智靈對VD的治療效應及作用機制，為中醫(yī)臨床治療VD提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性昆明小鼠100只，體質(zhì)量25 g～30 g，由河北省實驗動物中心提供 (昆明小鼠二級實驗動物，合格證號:612159)。

1.2 實驗材料

1.2.1 藥物:聰智靈由葛根、黃芪、當歸尾、桃仁、紅花、地龍、石菖蒲等中藥組成，常規(guī)水提純法制成1 g生藥/mL，課題組自制，冰箱保存，備用。尼莫地平片由河北醫(yī)科大學制藥廠生產(chǎn) (批號:H13022049)，實驗時用蒸餾水配制成濃度為3 mg/mL的混懸液。

1.2.2 主要試劑:AchE試劑盒:南京建成生物工程研究所生產(chǎn)，批號:20041115。

1.2.3 主要儀器:小鼠跳臺儀，中國醫(yī)學科學院藥物研究所;HM-200型電子天平，日本OLYMPUS公司;MSE-25型高速冷凍離心機:上海安亭科學儀器廠;半自動生化儀 (Humalyzer2000)，美國。

1.3 動物分組和模型制備 將小鼠隨機分為5組:假手術(shù)組、模型組、聰智靈高劑量組(簡稱高劑量組)、聰智靈低劑量組 (簡稱低劑量組)、尼莫地平組。參照文獻［1］制作腦缺血再灌注擬血管性癡呆動物模型。將動物用10%水合氯醛0.35 g/kg腹腔注射麻醉，頸正中部常規(guī)消毒后切口，分離雙側(cè)頸總動脈，套“4”號絲線扣，拉緊絲扣，阻斷血流20 min，同時在距尾尖1 cm處剪斷放血約0.3 mL，熱凝止血。松開絲扣使血液灌注10 min后，再次阻斷血流20 min，第2次再灌后觀察30 min，縫合皮膚。假手術(shù)組只分離頸總動脈，穿線但不結(jié)扎，尾部不放血，觀察時間與其他組相同。術(shù)后每日肌注青霉素0.2萬U，連續(xù)3 d。本實驗維持動物肛溫 (36±0.5)℃，防止低溫對缺血所致腦損傷的保護作用。

1.4 治療方法 術(shù)后當天動物蘇醒后開始治療。假手術(shù)組與模型組均灌服蒸餾水10 mL/kg體質(zhì)量，尼莫地平組灌服尼莫地平液30 mg/kg體質(zhì)量，低劑量組灌服聰智靈液29 g/kg體質(zhì)量 (相當于臨床成人用藥量的10倍)，高劑量組灌服聰智靈液58 g/kg體質(zhì)量 (相當于臨床成人用藥量的20倍)。各組均1次/d灌胃，連續(xù)治療15 d。

1.5 指標檢測

1.5.1 行為學檢測:于造模第15 d治療結(jié)束后進行。采用跳臺實驗。實驗裝置是一10 cm×10 cm×5 cm的小鼠跳臺反應箱，分為兩間，箱底為可通36 v連續(xù)電刺激的銅柵。每間右后角置一直徑和高均為4.5 cm的橡皮墊，作為小鼠回避電擊的安全區(qū)。實驗時先將小鼠置于跳臺儀中，適應環(huán)境3 min，然后底部銅柵通以交流電，記錄動物受到電刺激后跳上橡皮墊的反應時間和5 min內(nèi)受電擊的次數(shù) (錯誤次數(shù))，作為學習成績。24 h后將小鼠置于跳臺儀中適應3 min，再將其置于橡皮墊上，記錄第一次跳下橡皮墊的潛伏時間和5 min內(nèi)受電擊的次數(shù) (錯誤次數(shù))，作為記憶成績。

1.5.2 海馬組織AchE活力檢測:行為學檢測結(jié)束后在麻醉下斷頭處死小鼠，冰盤上快速剖取全腦，棄去嗅球及小腦。沿矢狀面方向?qū)⒛X組織對稱切開，取右側(cè)腦組織，分離海馬并稱重，按照重量和體積比1︰10的比例，加入生理鹽水冰浴勻漿，4℃ 4 000 r/min離心10 min，取上清液備測，采用分光光度法檢測AchE活力 (按試劑盒說明書進行檢測)。

2 結(jié)果

2.1 行為學檢測結(jié)果 表1示，模型組小鼠的反應時間明顯延長，潛伏時間顯著縮短，錯誤次數(shù)明顯增加，與假手術(shù)組比較差異有非常顯著性 (P＜0.01);各治療組與模型組比較，反應時間縮短，潛伏時間延長，錯誤次數(shù)明顯減少，學習成績與記憶成績均優(yōu)于模型組，差異有顯著性(P＜0.05或P＜0.01)，其中，高劑量組學習記憶成績均優(yōu)于低劑量組和尼莫地平組 (P＜0.05或P＜0.01)。

表1 各組小鼠學習記憶能力比較(跳臺法)(±s，n=10)

表1 各組小鼠學習記憶能力比較(跳臺法)(±s，n=10)

注:與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01;與尼莫地平組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與低劑量組比較，△P＜0.05

組別 學習成績反應時間 (s) 錯誤次數(shù) (次)記憶成績潛伏時間 (s) 錯誤次數(shù) (次)假手術(shù)組 21.24±8.48▲▲ 2.10±0.99▲▲ 247.99±51.77▲▲ 2.3±0.95▲▲模型組 63.08±14.68 7.80±2.78 81.10±36.72 7.90±2.81尼莫地平組 46.60±16.34▲▲ 5.20±2.39▲ 152.03±56.85▲▲ 5.20±2.30▲▲低劑量組 41.63±11.33▲▲ 4.80±2.66▲▲ 155.29±35.79▲▲ 5.50±2.60▲高劑量組 29.20±12.42▲▲＊＊△ 2.70±1.34▲▲＊△ 208.00±41.62▲▲＊△ 2.90±1.66▲▲＊△

2.2 AchE活性測定 表2示，模型組小鼠腦組織海馬區(qū)AchE活性較假手術(shù)組明顯下降 (P＜0.01)，各用藥組AchE活性均顯著高于模型組 (P＜0.01)，以聰智靈高劑量組優(yōu)于低劑量組和尼莫地平組 (P＜0.05)。

表2 各組小鼠海馬AchE活力比較(±s)

表2 各組小鼠海馬AchE活力比較(±s)

注:與模型組比較，▲▲P＜0.01;與尼莫地平組比較，*P＜0.05;與低劑量組比較，△P＜0.05

組別 n AchE(U/mgprot)假手術(shù)組 10 503.6±55.24▲▲模型組 10 346.86±52.56尼莫地平組 10 441.93±78.22▲▲低劑量組 10 436.04±62.63▲▲高劑量組 10 501.56±69.94▲▲＊△

3 討論

VD屬于中醫(yī)“呆病”、“善忘”、“文癡”等范疇。中醫(yī)學認為，“腦為元神之府”，“腦為髓?！?，髓海充實，則神清智明。VD患者多年老體弱，元氣不足，不能推動血液運行，以致腦絡瘀阻，氣血不得濡養(yǎng)腦髓，以致神明失養(yǎng)，靈機記性失常，出現(xiàn)學習障礙，記憶衰退，反應呆鈍等癥。正如《醫(yī)林改錯》所云:“元氣既虛，必不能達于血管，血管無氣，必停留而瘀?！笨梢奦D為本虛標實之證，正氣不足為本，瘀阻腦絡為標。課題組結(jié)合臨床經(jīng)驗，篩選具有益氣活血、祛瘀通絡、醒神開竅的葛根、黃芪、當歸尾、桃仁、紅花、地龍、石菖蒲等藥物組合成復方聰智靈。本方仿補陽還五湯重用生黃芪，以其大補元氣，意在氣旺以促血行，祛瘀而不傷正，且氣味俱輕，具有升發(fā)之性，對腦氣不足、九竅不通者，黃芪實為上品;配以當歸尾、桃仁、紅花等藥活血祛瘀;地龍通經(jīng)活絡;石菖蒲醒神開竅，健腦益智;葛根升舉清陽之氣，有利元氣上充于腦，并有活血祛瘀之功(《本草拾遺》載“升者破血”)。諸藥合用，可使氣旺血行，瘀祛絡通，腦髓得養(yǎng)，靈機記性漸歸于?！，F(xiàn)代研究證實，益氣活血中藥可明顯改善VD模型的學習記憶功能，［3-5］具有顯著的抗VD作用;石菖蒲所含揮發(fā)油具有抑制神經(jīng)細胞凋亡的作用，對癡呆模型動物學習記憶及認知功能有顯著改善作用;［6-7］葛根素能促進腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子表達，減少神經(jīng)細胞丟失，可明顯改善VD大鼠的學習記憶障礙。［8］

海馬是學習記憶功能非常重要的腦區(qū)。研究證實，海馬直接參與了信息貯存和回憶，是缺血損傷最敏感的腦區(qū)。［9］近年來，在癡呆發(fā)病機理中，中樞膽堿能系統(tǒng)的作用逐漸被認識，中樞膽堿能通路是學習記憶的主要通路，研究表明，VD的形成與中樞膽堿能系統(tǒng)的受損有關(guān)。乙酰膽堿 (acetyl-choline，Ach)為中樞膽堿能系統(tǒng)的重要神經(jīng)遞質(zhì)，與學習、記憶等功能有密切聯(lián)系。Ach由膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶 (ChAT)合成，被膽堿酯酶 (AchE)分解，通過Ach受體而發(fā)揮生物學效應。如果ChAT和AchE的活性異常，將會引起Ach代謝失調(diào)，致使中樞膽堿能系統(tǒng)的生化改變。AchE作為Ach的水解酶，其活力變化可間接反映乙酰膽堿的含量和代謝情況。AchE是生物神經(jīng)傳導中的關(guān)鍵性酶，該酶降解Ach，當AchE活力降低時，減弱了對乙酰膽堿的降解作用，致突觸間隙的乙酰膽堿濃度增高，使突觸后效應增強，提高了谷氨酸神經(jīng)興奮毒性作用。［10］至于VD海馬區(qū)AchE活性下降的可能原因［11］是:由于腦組織缺血缺氧，使三羧酸循環(huán)障礙，提供酶生物合成時所需要的原料和能量減少;AchE分布于膽堿能神經(jīng)元上，缺血再灌注損傷了海馬的膽堿能神經(jīng)元，致突觸數(shù)量減少，ChAT活性降低，Ach生成減少，AchE的活性相應下調(diào)。

本實驗采用雙側(cè)頸總動脈缺血再灌注復制VD模型，行為學檢測結(jié)果顯示，模型組小鼠學習和記憶成績均較假手術(shù)組顯著降低 (P＜0.01)，表明模型組學習和記憶能力障礙;益氣活血復方聰智靈與尼莫地平均可提高模型小鼠的學習記憶能力，表明聰智靈與尼莫地平均具有改善VD模型小鼠認知障礙的作用，尤以聰智靈高劑量組作用明顯。AchE檢測結(jié)果顯示，模型組海馬組織AchE活性顯著低于假手術(shù)組 (P＜0.01)，各用藥組AchE活性均顯著高于模型組 (P＜0.01)，提示腦缺血再灌注時膽堿能神經(jīng)元受損，AchE活性下降;中藥復方聰智靈能提高海馬區(qū)AchE活性，表明聰智靈減輕了缺血再灌注對海馬區(qū)膽堿能神經(jīng)元的損傷，且表現(xiàn)出量效關(guān)系。綜上，聰智靈改善VD模型小鼠學習記憶功能的機制，可能與減輕腦缺血再灌注對海馬神經(jīng)元損傷，提高海馬組織內(nèi)AchE活性有關(guān)。

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