食管黏膜NOX5表達與反流性食管炎關系的臨床研究

劉遠飛，許樹長，程 靜，吳 萍，張照杰

1.上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院消化內科，上海 200233;2.上海市同濟大學附屬同濟醫(yī)院消化內科;3.上海市同濟大學附屬同濟醫(yī)院臨床營養(yǎng)科

反流性食管炎(reflux esophagitis，RE)是由于酸性胃液或堿性腸液長期反復流入食管內，造成食管黏膜的慢性炎癥，主要并發(fā)癥之一是Barrett食管 (Barrett’s esophagus，BE)，BE 是一種癌前病變，與食管腺癌(esophageal adenocarcinoma，EA)密切相關。NOX家族NADPH氧化酶是跨膜傳遞電子的蛋白，包括NOX1、NOX2、NOX3、NOX4、NOX5、DUOX 與 DUOX2。NOX5在2001年被首次報道，隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)NOX5可能與BE、EA的發(fā)病機制相關，但目前NOX5與RE的關系國內外尚未見報道。本文通過研究NOX5在正常人和RE患者食管黏膜的mRNA表達水平，初步探討NOX5是否參與RE的發(fā)病及可能的作用機制，以便為進一步闡明RE發(fā)病機制提供新的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 所有RE入選病例均為上海同濟大學附屬同濟醫(yī)院2009年5月－2010年3月消化科門診患者，胃鏡檢查中按洛杉磯標準確診為RE，用14C呼氣試驗檢測幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，H.pylori)為陰性的患者納入本實驗。RE診斷標準:內鏡下可見起至食管遠端的黏膜破損，共收集病例32例，其中RE(A級)20例，RE(B級及以上)12例。病例排除標準:(1)內鏡下胃、十二指腸潰瘍(無論活動期或靜止期)，糜爛性十二指腸炎;(2)內鏡下消化道腫瘤;(3)上消化道手術史;(4)懷疑或證實有惡性腫瘤;(5)有高血壓、心臟病、糖尿病、肝硬化、腎功能不全、腦血管病史;(7)慢性萎縮性胃炎;(8)近期口服非甾體抗炎藥、糖皮質激素及飲酒史。正常對照組25例，來自門診體檢患者，目前身體狀況正常，內鏡檢查胃黏膜基本正常，且用14C呼氣試驗檢測H.pylori均為陰性患者。病例排除標準同前，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 試劑和儀器 Trizol提取液(Invitrogen公司)、逆轉錄試劑盒(Toyobo Biochemicals，Osaka，Japan)、熒光定量PCR試劑(Light Cycler DNA Master SYBR Green I，Takara Biochemicals)、熒 光 定 量 PCR 儀(Roche Molecular Biochemicals，Manheim，Germany)。

1.3 方法

1.3.1 標本采集:應用日本OLYMPUS-260型電子胃鏡進行上消化道內窺鏡檢查，RE患者取食管黏膜破損處組織1塊，正常人胃食管結合部上1 cm，3點處取組織1塊，活檢組織立即轉入－80℃冰箱待檢。內鏡檢查及活檢取材均由同一位醫(yī)師完成。

1.3.2 RNA 抽提和 cDNA 合成:從 －80°C 冰箱取出食管黏膜組織，嚴格按Trizol說明書提取組織總RNA，用OD260/OD280檢測RNA純度和濃度。用逆轉錄試劑盒將 RNA逆轉錄為 cDNA，將逆轉錄產物保存于－20℃冰箱中待用。

1.3.3 引物設計:由上海生工生物有限公司設計合成(見表1)。

1.3.4 熒光定量PCR:將制備好的cDNA進行PCR擴增，擴增體系如下:Light Cycler DNA Master SYBR Green I 10 μL，上游引物 0.3 μL，下游引物 0.3 μL，模板1.5 μL，DEPC 處理水 7.9 μL，總體積20 μL，同時設陰性對照組，應用Roche Light Cycler system進行熒光PCR擴增，反應條件為:95℃預變性1 min，95℃ 15 s，57℃ 25 s，共60個循環(huán)，所有實驗標本均重復擴增3次，反應結束后根據(jù)PCR擴增曲線(見圖1)，電腦自動分析熒光信號得出各測量標本的Ct(Threshold cycle)值、溶解曲線及電泳分析產物特異性(見圖2、3)。real-time PCR結果采用相對定量值分析能準確反映目的基因的表達情況，計算公式為2－ΔCt，其結果反映和 β-actin比較目的基因的相對量。即ΔCt(目的基因)=Ct(目的基因)－Ct(β-actin)，ΔCt值越低，說明基因表達絕對量越高，取其相反數(shù)后結果也相反。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequence

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗，數(shù)值以平均值 ± 標準差()表示，P ＜0.05 表示差異有顯著性。

2 結果

2.1 RE組和對照組性別構成、平均年齡比較 RE組的性別構成、平均年齡與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05，見表2)。

表2 RE組和正常對照組性別構成、平均年齡比較Tab 2 The comparison of average age and gender between RE group and normal control group

2.2 RE組與正常對照組食管黏膜NOX5的相對表達倍數(shù)比較 RE組(n=32)食管黏膜NOX5的相對表達倍數(shù)為 0.947 ±0.422，正常對照組(n=25)食管黏膜NOX5的相對表達倍數(shù)為0.975±1，兩組食管黏膜NOX5的相對表達差異無統(tǒng)計學意義(P=0.495)。

2.3 RE(A級)、RE(B級及以上)及正常對照組食管黏膜NOX5的相對表達倍數(shù)比較 RE(A級)、RE(B級及以上)及正常對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P=0.268，P=0.197)，RE(A 級)與 RE(B 級及以上)相比，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.034，見表3)。

3 討論

RE是一種常見的消化道動力障礙性疾病，發(fā)病率約2%，但其發(fā)病機制尚不明確。BE是RE的主要并發(fā)癥之一，是一種癌前病變，與EA密切相關。隨著食管腺癌的發(fā)病率上升，RE、BE受到了越來越多的關注。Ouatu-Lascar等［1］研究發(fā)現(xiàn):BE患者長期使用質子泵抑制劑(proton pump inhibitors，PPI)顯著減少了化生細胞的增殖，BE患者用PPI治療后顯著減少了黏膜發(fā)育異常的發(fā)生率，這些研究表明在BE患者，酸反流可能在黏膜組織轉化-發(fā)育異常-腺癌中起重要作用。Fu等［2］研究發(fā)現(xiàn)，酸刺激 BE和 EA細胞，NOX5表達增高，機制可能為:酸刺激可能通過cAMP效應元件結合蛋白誘導 NOX5ε表達，提示 NOX5ε可能在BE-EA的過程中起重要作用。

表3 RE(A級)、RE(B級及以上)及正常對照組食管黏膜NOX5的相對表達倍數(shù)比較Tab 3 NOX5 mRNA expression in esophageal mucosa between control group，RE(A grade)and RE(B grade and above)

NOX5在2001年被首次報道［3-4］，相繼發(fā)現(xiàn)NOX5 mRNA在睪丸、脾臟、淋巴結、血管平滑肌、骨、胰腺、子宮、卵巢、胃、多種胎兒組織中表達［3-5］。NOX5 與NOX1-4不同的是有胞內長NH2端，其含有Ca2+結合域EF手［6］，其激活不像 NOX1-4酶依靠 p22phox，而是依靠細胞質內 Ca2+濃度的增加［7］。研究發(fā)現(xiàn):NOX5主要分為NOX5-L和NOX5-S兩種亞型，Si等［8］研究發(fā)現(xiàn):在seg1-腺癌細胞，NOX5-S的mRNA表達顯著高于食管鱗狀上皮細胞，酸刺激seg1-腺癌細胞后NOX5-S的mRNA表達增高，這些研究表明NOX5-S可能在BE-EA的過程中起重要作用。

Fu等［2］研究發(fā)現(xiàn):BE伴不典型增生的患者NOX5表達顯著高于BE不伴不典型增生的患者，而兩組間的NOX5-L表達無明顯差異，提示BE患者食管黏膜表達NOX5-L和NOX5-S，而NOX5-S在BE伴不典型增生中過表達增加。Fu等［2］研究還發(fā)現(xiàn):SEG-1腺癌細胞 NOX5-S表達上調，COX-2表達上調;沉默NOX5-S表達后，COX-2表達顯著減少，推測 NOX5-S可能參與了介導COX-2的表達。而研究已證實:食管炎(由輕到重)前列腺素水平主要依賴COX-2的活動，并隨其活動性呈漸進性增加［9］，由此我們推測:RE患者食管黏膜NOX-S的表達應較正常對照組高。我們的研究發(fā)現(xiàn)，RE患者與正常人食管黏膜NOX5 mRNA表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P=0.901)，正常人與RE(A級)、RE(B級及以上)患者食管黏膜NOX5 mRNA表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P=0.268、P=0.197)，這一結果可能與食管黏膜表達NOX5兩類亞型NOX5-L和NOX5-S，致使正常人與RE患者NOX5 mRNA表達總量無統(tǒng)計學差異。我們的研究同時發(fā)現(xiàn):RE(A級)與 RE(B級及以上)患者食管黏膜NOX5 mRNA表達水平差異有統(tǒng)計學意義(P=0.034)，RE(B級及以上)患者食管黏膜NOX5 mRNA表達水平相對增高。結合食管炎活動性(由輕到重)隨COX-2水平漸進性增加，NOX5-S可能參與了介導COX-2的表達，我們推測:由于RE(B級及以上)較RE(A級)患者食管黏膜NOX5-S mRNA表達水平增高，導致了食管黏膜NOX5 mRNA表達水平相對增高。

總之，正常人和RE患者食管黏膜NOX5 mRNA表達水平無明顯差異，RE(B級及以上)較RE(A級)患者食管黏膜NOX5 mRNA表達水平相對增高，而RE(B級及以上))患者食管黏膜NOX5 mRNA表達水平增高可能與NOX5-S mRNA表達增高有關。

［1］Ouatu-Lascar R，F(xiàn)itzgerald RC，Triadafilopoulos G.Differentiation and proliferation in Barrett’s esophagus and the effects of acid suppression［J］.Gastroenterology，1999，117(2):327-335.

［2］Fu X，Beer DG，Behar J，et al.cAMP-response element-binding protein mediates acid-induced NADPH oxidase NOX5-S expression in Barrett esophageal adenocarcinoma cells［J］.J Biol Chem，2006，281(29):20368-20382.

［3］Bánfi B，Molnár G，Maturana A，et al.A Ca(2+)-activated NADPH oxidase in testis，spleen，and lymph nodes［J］.J Biol Chem，2001，276(40):37594-37601.

［4］Cheng G，Cao Z，Xu X，et al.Homologs of gp91phox:cloning and tissue expression of Nox3，Nox4，and Nox5［J］.Gene，2001，269(1-2):131-140.

［5］Salles N，Szanto I，Herrmann F，et al.Expression of mRNA for ROS-generating NADPH oxidases in the aging stomach［J］.Exp Gerontol，2005，40(4):353-357.

［6］Bánfi B，Tirone F，Durussel I，et al.Mechanism of Ca2+activation of the NADPH oxidase 5(NOX5)［J］.J Biol Chem，2004，279(18):18583-18591.

［7］Kawahara T，Ritsick D，Cheng G，et al.Point mutations in the proline-rich region of p22phox are dominant inhibitors of Nox1-and Nox2-dependent reactive oxygen generation［J］.J Biol Chem，2005，280(36):31859-31869.

［8］Si J，F(xiàn)u X，Behar J，et al.NADPH oxidase NOX5-S mediates acid-induced cyclooxygenase-2 expression via activation of NF-kappaB in Barrett’s esophageal adenocarcinoma cells［J］.J Biol Chem，2007，282(22):16244-16255.

［9］Lanas A，Jiménez P，F(xiàn)errández A，et al.Selective COX-2 inhibition is associated with decreased mucosal damage induced by acid and pepsin in rabbit esophagitis［J］.Inflammation，2003，27(1):21-29.