煙酸抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞C反應(yīng)蛋白的表達(dá)

張 波 劉宏斌

解放軍總醫(yī)院心內(nèi)科，北京 100853

作為一種調(diào)脂藥物，煙酸已用于預(yù)防和治療動脈粥樣硬化達(dá)數(shù)十年之久。煙酸可有效降低血清甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL）以及脂蛋白（a）[Lp(a)]，同時有升高高密度脂蛋白（HDL）的作用[1]。臨床研究證實煙酸單獨或與其他調(diào)脂藥物聯(lián)合應(yīng)用，可延緩甚至逆轉(zhuǎn)動脈粥樣硬化的進(jìn)展，降低高脂血癥患者及冠心病患者的心血管事件發(fā)生率和總死亡率[2]。過去公認(rèn)這些效應(yīng)是煙酸降脂作用的結(jié)果，但近年來一些基礎(chǔ)研究表明煙酸具有不依賴其調(diào)脂效應(yīng)的抗動脈粥樣硬化和抗炎癥作用[3]。

C反應(yīng)蛋白（CRP）是急性炎癥反應(yīng)敏感但并非特異性的標(biāo)記物，許多臨床研究和Meta分析認(rèn)為血清CRP水平與多種心血管危險因子相關(guān)，能獨立預(yù)測未來心血管事件[4]。另一方面，多個可靠實驗的結(jié)果表明CRP不僅僅是動脈粥樣硬化的預(yù)測者，其大量的存在于動脈粥樣病變中，啟動多個致動脈粥樣硬化信號通路，直接參與了動脈粥樣斑塊的形成與進(jìn)展[5]。

有研究證實，3個月的煙酸治療能顯著降低血清CRP水平（15%）[6]，但沒有直接的證據(jù)描述煙酸對內(nèi)皮細(xì)胞CRP表達(dá)的影響。我們擬設(shè)計實驗探討煙酸對血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞CRP表達(dá)的影響及其作用機制。本研究將促進(jìn)對煙酸藥理作用認(rèn)識的進(jìn)一步深入，為煙酸的臨床使用提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株為川北醫(yī)學(xué)院風(fēng)濕免疫研究所提供。

1.1.2 血管緊張素Ⅱ、煙酸（美國Sigma公司），DMEM培養(yǎng)基（Gibco BRL公司）；胎牛血清（HyClone北京生物化學(xué)制品有限公司）；定量 PCR 試劑盒（ABGAB）；CRP、β-actin 引物由上海生工合成；CRP、NF-κB p65、β-actin 抗體購于 Santa Cruz公司。其余試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。熒光定量PCR儀（ABI 7900TH）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株用含10%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基加100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素，于37℃、5%CO2的孵箱中孵育。在70%～80%融合后，置于無血清培養(yǎng)基中孵育12 h備用。實驗分為對照組（NC組）、

AngⅡ組和AngⅡ+Niacin組，NC組HUVECs不做任何處理；AngⅡ組用血管緊張素Ⅱ（1 μmol/L）孵育 12 h，然后行 PCR和Western Blot；AngⅡ+Niacin組 HUVECs在血管緊張素Ⅱ（1 μmol/L） 孵育 12 h 前先用煙酸 1 mM 分別處理 1、2、6、12及24 h，用血管緊張素Ⅱ（1 μmol/L）孵育 12 h后行 PCR 和Western Blot，確定CRP蛋白和mRNA表達(dá)量最小的時間，然后以此時間點用不同濃度煙酸（0.25、0.5、1.0 mmol/L）預(yù)處理HUVECs，再用血管緊張素Ⅱ（1 μmol/L）孵育 12 h，然后行 PCR和Western Blot。

1.2.2 Realtime RT-PCR總RNA的提取采用TRI Reagent法，按照說明書所示規(guī)程提取總RNA，使用分光光度計測定RNA的濃度和純度。RNA提取后依照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作合成cDNA。以β-actin為內(nèi)參擴(kuò)增CRP基因。β-actin上游引物（產(chǎn)物 194 dp）：5'-AGGACTGTGTTGGCGTACAG-3'，下游引物：5'-TCCCTGGAGAAGAGCTACGA-3'。CRP 上游引物（產(chǎn)物 133 dp）：5'-ACTTCCTATGTATCCCTCAAAG-3'，下游引物：5'-CTCATTGTCTTGTCTCTTGGT-3'。 用 2-ΔΔCt方法處理實時定量數(shù)據(jù)，計算CRP mRNA的表達(dá)。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.2.3 Western Blot analysis CRP蛋白提取 用RIPA裂解液收集細(xì)胞，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度；核蛋白提取：用細(xì)胞刮將細(xì)胞從培養(yǎng)瓶中刮取下來后，再用PBS洗滌3次，1 000 r/min 5 min離心，收集沉淀后按照核蛋白提取試劑盒提取核蛋白；利用10%的SDS-PAGE膠進(jìn)行分離等量蛋白，然后轉(zhuǎn)膜、封閉，加入的兔抗人CRP抗體（1∶1 000稀釋）或 NF-κB p65 抗體（1∶200 稀釋）4℃孵育 12 h，洗膜后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶5 000稀釋），室溫孵育1 h，洗膜后采用電化學(xué)顯影，X線片曝光，并對顯影條帶進(jìn)行灰度掃描做相對定量分析。以β-actin為內(nèi)參照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理數(shù)據(jù)，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料采用百分率表示，組間對比采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

煙酸抑制血管緊張素誘導(dǎo)的HUVECs中CRP mRNA及蛋白的表達(dá)以NC組作為對照，AngⅡ組CRP mRNA相對表達(dá)量為（11.31±0.63）；在煙酸（1 mmol/L）處理 1、3、6、12 及 24 h后再加入 AngⅡ孵育 12 h，AngⅡ+Niacin組 CRPmRNA較NC 組 的 相 對 表達(dá) 量 分 別 為（8.83±0.45）、（6.81±0.52）、（4.74±0.37）、（3.30±0.25）、（2.25±0.17）。 1、3、6、12 和 24 h AngⅡ+Niacin組CRP mRNA表達(dá)較AngⅡ組均有顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.033 0、P=0.005 3、P=0.000 8、P=0.000 3、P=0.000 2），且mRNA表達(dá)隨時間延長有降低趨勢。AngⅡ+Niacin組CRP蛋白表達(dá)較AngⅡ組也隨著時間延長明顯降低（圖1）。以 NC組作為對照，當(dāng) HUVECs分別用0.25、0.50及 1.0 mmol/L的煙酸預(yù)處理 24 h后，AngⅡ+Niacin 組的CRP mRNA 相對表達(dá)量分別為（8.92±0.37）、（5.75±0.53）、（2.91±0.48）。 與 AngⅡ組相比，0.25、0.5 和 1.0 mmol/L AngⅡ+Niacin組CRP mRNA表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.030 8、P=0.002 5、P=0.000 5），且 mRNA 表達(dá)隨濃度增加有降低趨勢。AngⅡ+Niacin組CRP蛋白表達(dá)較AngⅡ組也隨著濃度增加明顯降低（圖2）。

煙酸抑制AngⅡ誘導(dǎo)的NF-κB蛋白表達(dá)AngⅡ為血管緊張素Ⅱ1 μmol/L處理 12 h后 HUVECs中 CRP和 NF-κB p65蛋白的表達(dá)；Niacin+AngⅡ為1 mmol/L煙酸預(yù)處理24 h，再用血管緊張素Ⅱ1 μmol/L處理12 h后HUVECs中 CRP和NF-κB p65蛋白的表達(dá)。根據(jù)Western Blot結(jié)果顯示，AngⅡ+Niacin組與AngⅡ組相比，NF-κB蛋白表達(dá)有明顯下降，同時CRP蛋白表達(dá)呈同步下降趨勢（圖3）。

圖3 煙酸抑制血管緊張素II誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞CRP和NF-κB p65蛋白表達(dá)

3 討論

目前，動脈粥樣硬化是一種炎癥性疾病的觀點已得到研究者公認(rèn)，炎癥貫穿了動脈粥樣斑塊的形成、進(jìn)展和破裂的全過程。在炎性標(biāo)志物中，C反應(yīng)蛋白是最具代表性的一種。近來的研究發(fā)現(xiàn)，除了其炎癥標(biāo)志物的功能外，CRP存在于動脈粥樣斑塊以及血管內(nèi)皮細(xì)胞等諸多細(xì)胞中[7-8]，可誘導(dǎo)參與動脈粥樣硬化的多種細(xì)胞的炎癥[9-10]，直接參與了動脈粥樣硬化的進(jìn)程[5]。

煙酸是最早應(yīng)用于臨床的調(diào)脂藥物，但眾多副作用限制了其臨床應(yīng)用，隨著劑型的改進(jìn)特別是緩釋劑型的應(yīng)用，煙酸類藥物又重新獲得了研究者的關(guān)注。近年來的研究發(fā)現(xiàn)許多研究提示煙酸具有獨立于降脂效應(yīng)的抗動脈粥樣硬化作用。在內(nèi)皮細(xì)胞中，煙酸通過降低氧自由基產(chǎn)物、氧化的低密度脂蛋白以及炎癥因子能抑制血管炎癥[11]。動物實驗中，在血脂水平不變的條件下，煙酸能抑制血管炎癥和內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)[12]。在一個隨機、雙盲、安慰劑對照的臨床實驗中，緩釋型煙酸能改善冠狀動脈疾病患者的內(nèi)皮功能失調(diào)[13]。本研究探討了煙酸對血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的人頸靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中CRP表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)煙酸能抑制AngⅡ誘導(dǎo)的HUVECs中CRP mRNA和蛋白的表達(dá)，而且這種抑制呈時間和濃度依賴性。

有多個實驗的結(jié)果提示煙酸抑制血管炎癥的能力可能與抑制NF-κB活性有關(guān)[11，14]，而也有研究證實AngⅡ誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞CRP表達(dá)的機制可能是激活NF-κB。因而本研究探討了煙酸對血管緊張素誘導(dǎo)的NF-κB活性的影響，發(fā)現(xiàn)煙酸能抑制AngⅡ誘導(dǎo)NF-κB p65蛋白的表達(dá)，且CRP蛋白表達(dá)也同步降低，提示抑制NF-κB可能是煙酸抑制AngⅡ誘導(dǎo)的HUVECs中CRP表達(dá)的分子機制之一。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)煙酸通過抑制NF-κB減少了AngⅡ誘導(dǎo)人頸靜脈內(nèi)皮細(xì)胞CRP的表達(dá)，促進(jìn)了我們對煙酸抗動脈粥樣硬化和抗炎癥作用機制理解的進(jìn)一步深入，為煙酸的臨床使用方面提供了新的實驗依據(jù)。

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