膠體金法檢測在判定耐甲氧西林金黃色葡萄球菌中的價值探討

林 翀 蘇應(yīng)仙 林明冠 張?zhí)煳?/p>

海南省農(nóng)墾總局醫(yī)院檢驗(yàn)科，海南海口 570311

金黃色葡萄球菌（staphyloccocus aureus）是人類的一種重要病原菌，隸屬于葡萄球菌屬，可引起多種嚴(yán)重感染[1]。隨著抗菌藥物的種類不斷增加及臨床廣泛應(yīng)用，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）在全球范圍內(nèi)不斷增加，成為院內(nèi)、外感染的重要病原菌之一。2001年我國的全國調(diào)查報告顯示，MRSA在金黃色葡萄球菌中所占的比例波動在40%～90%之間[2-3]。本研究通過比較苯唑西林藥敏紙片擴(kuò)散法、乳膠凝集法及膠體金法判定MRSA株的情況，旨在探討膠體金法檢測判定MRSA株的價值，現(xiàn)將相關(guān)的臨床資料總結(jié)并報道如下：

1 資料與方法

1.1 菌株來源

收集2008年3月～2009年2月從我院住院或門診患者的痰液、清潔中段尿、膿液等各種臨床標(biāo)本中分離出的金黃色葡萄球菌75株，質(zhì)控菌采用金黃色葡萄球菌ATCC25923，購于衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心，以2010年CLSI為判斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 方法

將收集到的75株金黃色葡萄球菌分別采用苯唑西林（1 μg/片）藥敏紙片擴(kuò)散法、乳膠凝集法及膠體金法檢測。

1.2.1 苯唑西林藥敏紙片擴(kuò)散法 采用苯唑西林藥敏紙片擴(kuò)散法檢測75株金黃色葡萄球菌，若苯唑西林藥敏紙片抑制圈的直徑≤10 mm，可判斷為MRSA。苯唑西林藥敏紙片由Oxoid公司提供，在有效期內(nèi)使用。

1.2.2 乳膠凝集法 首先提取標(biāo)本中的PBP2a蛋白，然后用包被有抗PBP2a單克隆抗體的乳膠顆粒進(jìn)行凝集檢測。乳膠試劑反應(yīng)圈產(chǎn)生凝集時為PBP2a陽性，菌株為MRSA。乳膠凝集試劑由Oxoid公司提供，嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行。

1.2.3 膠體金法 提取標(biāo)本中的PBP2a蛋白，加樣于檢測試紙條，試紙條檢測帶和質(zhì)控帶均有顯色條帶則為陽性，即判斷為MRSA，僅質(zhì)控帶顯色條帶的為陰性，如質(zhì)控帶未出現(xiàn)條帶，則為體系失效[4]。采用北京青元盛康生物醫(yī)藥有限公司生產(chǎn)的MRSA膠體金法試劑盒，嚴(yán)格按說明書進(jìn)行操作。

1.3 觀察指標(biāo)

觀察苯唑西林藥敏紙片擴(kuò)散法、乳膠凝集法及膠體金法的檢測MRSA的敏感度及檢測時間并進(jìn)行比較分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，三組間比較采用方差分析，組間兩兩比較，采用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三種方法檢測MRSA敏感度及符合率情況

苯唑西林藥敏紙片擴(kuò)散法和膠體金法的檢測敏感度均高于乳膠凝集法，但經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；膠體金法與苯唑西林藥敏紙片擴(kuò)散法檢測MRSA的符合率高達(dá)100.0%。見表1。

表1 三種方法檢測MRSA的敏感度比較（株）

2.2 三種方法檢測時間比較

苯唑西林藥敏紙片擴(kuò)散法的檢測時間為（1080.6±36.3）min，乳膠凝集法的檢測時間為（38.2±1.7）min，膠體金法的檢測時間最短，僅為（9.2±0.4）min，膠體金法與苯唑西林藥敏紙片擴(kuò)散法及乳膠凝集法比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

3 討論

目前臨床上由于MRSA的出現(xiàn)致使感染趨勢不斷上升，多重耐藥性增加，現(xiàn)有的抗生素很難控制這些耐藥菌株的感染，正確快速的檢測MRSA并找出有效控制其感染的藥物，是目前臨床微生物工作的任務(wù)之一。本研究通過比較苯唑西林藥敏紙片擴(kuò)散法、乳膠凝集法及膠體金法判定MRSA株的情況，探討膠體金法檢測在判定MRSA株中的價值。

根據(jù)苯唑西林藥敏紙片抑制圈≤10 mm來判斷MRSA是一種簡便的方法，但耗時長，而且容易受到如培養(yǎng)基、細(xì)菌接種量、藥物濃度及培養(yǎng)時間的等諸多因素的影響。做好培養(yǎng)基的室內(nèi)質(zhì)控是準(zhǔn)確判斷MRSA的重要手段，但花費(fèi)的時間更長，不利于為臨床MRSA檢測提供準(zhǔn)確而快速的診斷。

乳膠凝集法快速、簡便，且無需特殊儀器和技術(shù)，對臨床早期檢出MRSA很有幫助，但檢測成本高，且因?yàn)镻BP2a的低表達(dá)可能會產(chǎn)生假陰性[3]。

膠體金是一種常用的標(biāo)記技術(shù)，是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗體的一種新型的免疫標(biāo)記技術(shù)，有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)[5]，近年已在各種生物學(xué)研究中廣泛使用，在臨床使用的免疫印跡技術(shù)中幾乎都使用其標(biāo)記。同時，在流式、電鏡、免疫、分子生物學(xué)以至生物芯片中均可能用到。膠體金是金的水溶膠，膠體金法是指以膠體金為顯色標(biāo)記物的檢法方法[6]。1971年Faulk和Taytor將膠體金引入免疫化學(xué)，此后免疫膠體金技術(shù)作為一種新的免疫學(xué)方法，在生物醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域得到了日益廣泛的應(yīng)用。膠體金是由氯金酸（HAuCl4）在還原劑如白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等作用下，聚合成的一定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，形成帶負(fù)電的疏水膠溶液，由于靜電作用而成為穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱膠體金。膠體金在弱堿環(huán)境下帶負(fù)電荷，可與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團(tuán)形成牢固的結(jié)合，由于這種結(jié)合是靜電結(jié)合，所以不影響蛋白質(zhì)的生物特性。除了與蛋白質(zhì)結(jié)合以外，膠體金還可以與許多其他生物大分子結(jié)合，如SPA、PHA、ConA等。根據(jù)膠體金的一些物理性狀，如高電子密度、顆粒大小、形狀及顏色反應(yīng)，加上結(jié)合物的免疫和生物學(xué)特性，使膠體金廣泛地應(yīng)用于免疫學(xué)、組織學(xué)、病理學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域。膠體金標(biāo)記實(shí)質(zhì)上是蛋白質(zhì)等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程。杜玉萍等[7]以金黃色葡萄球菌菌體抗原免疫家兔獲得多克隆抗血清，利用膠體金免疫層析技術(shù)，采用二步法檢測金黃色葡萄球菌，建立的膠體金免疫層析試紙法能在60 min內(nèi)完成檢測，靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示其檢測靈敏性為1×106cfu/mL；特異性實(shí)驗(yàn)檢測顯示其與副溶血弧菌、鼠傷寒沙門氏菌、痢疾桿菌、霍亂弧菌小川型、O139型及569B型等菌無交叉反應(yīng)，但與耶爾森氏菌、大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株（ATCC25922）、銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)株（ATCC27853）有一定交叉。有學(xué)者用膠體金標(biāo)記產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌多價抗體，先制成膠體金探針，進(jìn)而制成檢測產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌免疫層析法（GICA）檢測試紙條，用該法檢測產(chǎn)腸毒素葡萄球菌，具有簡便、快速、特異性好、無需儀器及細(xì)菌抗原無需進(jìn)行特殊處理等優(yōu)點(diǎn)，預(yù)示著本方法具有廣闊的應(yīng)用前景[8-10]。

本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，膠體金法和苯唑西林藥敏紙片擴(kuò)散法的符合率達(dá)100%，兩者敏感性均高于乳膠凝集法，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.260，P＞0.05），且膠體金法的檢測時間最短，僅為（9.2±0.4）min。

綜上所述，膠體金法是一種快速、準(zhǔn)確的判定MRSA菌株的方法，值得進(jìn)一步研究。

[1]劉蘭芳，郭思健.438株金黃色葡萄球菌耐藥性分析[J].南華大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2004，32（4）：510.

[2]馬越，金少鴻.我國細(xì)菌耐藥性監(jiān)測研究的新特點(diǎn)[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2005，28（4）：344-348.

[3]張國祥.112例耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的臨床特征[J].中外醫(yī)學(xué)研究，2010,8（23）：77-78.

[4]邵軍軍，?；菔|.膠體金免疫層析試紙條在病原體檢測及醫(yī)學(xué)診斷中的應(yīng)用[J].實(shí)用診斷與治療雜志，2008，22（1）：39.

[5]陳映紅.膠體金法檢測HBsAg的方法學(xué)評價[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2009，25（14）：2196.

[6]宗揚(yáng)勇，朱愛娟.膠體金法在梅毒實(shí)驗(yàn)診斷中的應(yīng)用價值[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2009，18（4）：430.

[7]杜玉萍，陳清，王雅賢，等.膠體金免疫層析法檢測金黃色葡萄球菌的初步研究[J].熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2006，6（6）：650-652.

[8]許保疆，郭成留.免疫層析快速診斷試紙條的制備及在動物疫病診斷上的應(yīng)用[J].中國畜牧獸醫(yī)，2009，36（3）：48.

[9]王清，吳振廷，王學(xué)林，等.免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)及其在植物保護(hù)上的應(yīng)用前景[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，33（3）：485.

[10]許欣，王鋒.免疫膠體金技術(shù)及其在臨床診斷上的研究進(jìn)展[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報，2009，21（6）：125.