單采血小板保存期間部分參數(shù)的改變及其意義

曹 惠 卓海龍 徐麗娟 王海平 王全立

1.解放軍總醫(yī)院輸血科，北京 100853；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院輸血科，北京 100039

血小板是止血機(jī)制中的一個(gè)重要因素，具有止血、凝血、修補(bǔ)破損血管的功能。血小板輸注適用于血小板生成障礙、功能障礙性疾病及預(yù)防性血小板輸注患者。血小板在收集、離心、存儲(chǔ)期間，若條件不當(dāng)而被激活，可造成“儲(chǔ)存損傷”影響血小板質(zhì)量，導(dǎo)致輸注無(wú)效[1]。本文檢測(cè)并分析機(jī)采血小板在22℃震蕩保存過(guò)程中發(fā)生的一系列形態(tài)和功能的變化，旨在為臨床輸注血小板和評(píng)價(jià)血小板輸注效果提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究使用血小板均取自2008年5月～2010年5月解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院輸血科，血小板為機(jī)采血小板，置于22℃震蕩儀上儲(chǔ)存。

1.2 儀器與試劑

xs-800i全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀及配套試劑（Sysmex公司，試劑均在有效期內(nèi)使用），XHZ-1型血小板恒溫振蕩保存箱（華通公司），Anti-human CD62p（eBioscience 公司），Human S1P Elias Kit（北京UBIO生物技術(shù)公司）。

1.3 方法

1.3.1 樣本收集

隨機(jī)抽取本中心采集的機(jī)采血小板16份，在無(wú)菌環(huán)境下收集保存 1、3、5、7 d 的血小板 3 mL。

1.3.2 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.2.1 血小板常規(guī)參數(shù)檢驗(yàn) 使用Sysmex xs-800i全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀檢測(cè)血小板體積分布寬度（platelet distribution width，PDW）、 血小板數(shù)（platelet，PLT）、 平均血小板體積（meam platelet volume， MPV）

1.3.2.2 血小板活化率的檢測(cè) 收集血小板懸液1 mL，將其1 500 r/min離心5 min后棄上清，用PBS緩沖液重懸血小板，調(diào)整血小板濃度至 5×106/mL，加入 5 μL CD62p-FITC 室溫避光孵育30 min，PBS緩沖液洗滌兩次后，以500 μL PBS重懸血小板，即刻上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3.2.3 血小板懸液中S1P（1-磷酸鞘氨醇）濃度檢測(cè) 收集血小板懸液1 mL，12 500 r/min離心5 min后，上清分裝于-20℃凍存待檢。按照UBIO公司的Human S1P（sphingosine-1-phosphate）檢測(cè)試劑盒的操作步驟操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

不同保存時(shí)間的機(jī)采血小板的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可見(jiàn)，血小板常規(guī)參數(shù)檢驗(yàn)：機(jī)采血小板在保存1、3、5、7 d后，檢測(cè)其常規(guī)指標(biāo)顯示，PDW呈上升趨勢(shì)，PLT呈下降趨勢(shì)，MPV呈上升趨勢(shì)?；罨剩簷C(jī)采血小板在保存1、3、5、7 d 后，檢測(cè)其活化率（CD62p 表達(dá)率）顯示，隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，活化率有上升的趨勢(shì)。S1P濃度：機(jī)采血小板在保存1、3、5、7 d后，檢測(cè)其保存上清中的S1P濃度顯示，隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，在前5 d S1P1濃度有上升的趨勢(shì)，在第7天有所下降。

3 討論

MPV是經(jīng)血液分析儀測(cè)量后求出的血小板平均體積，代表單個(gè)血小板的平均體積。PDW是血小板體積的變異度，是由血液分析儀對(duì)血小板分布情況進(jìn)行數(shù)據(jù)分析后得到的，反映血小板的離散度[2]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在血小板的保存過(guò)程中，MPV和PDW的數(shù)值都呈上升趨勢(shì)，說(shuō)明血小板的體積變大，離散度增加。同時(shí)結(jié)合血小板的活化率升高，推測(cè)血小板在保存中有部分被活化，可能腫脹和伸出偽足，導(dǎo)致體積增大，并且與沒(méi)有活化的血小板的體積間形成差距，導(dǎo)致PDW的升高。有研究發(fā)現(xiàn)，PDW在血小板活化和聚集時(shí)變化明顯，可作為血小板活化的新指標(biāo)[3]。本研究顯示，PLT下降，可能是部分血小板由于新陳代謝衰竭或其他原因?qū)е碌蛲?，而又沒(méi)有新的血小板生成所致。

表1 不同保存時(shí)間的機(jī)采血小板的檢測(cè)結(jié)果（±s）

表1 不同保存時(shí)間的機(jī)采血小板的檢測(cè)結(jié)果（±s）

注：與保存 1 d 比較，*P<0.05，**P<0.01；與保存 3 d 比較，#P<0.05，##P<0.01；與保存 5 d 比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01

指標(biāo) 保存1 d 保存3 d 保存5 d 保存7 d PDW（%）PLT（109/L）MPV（fL）活化率（%）S1P濃度（nmol/L）9.93±1.05 936.83±47.83 8.95±0.60 34.88±1.63 323.53±125.62 9.90±1.02 931.00±64.72 9.08±0.54 48.79±3.51*469.33±104.32**11.92±0.71*#786.33±100.86**##10.28±0.18**##43.42±29.3 481.15±124.69**14.37±2.94*#742.83±128.07**##11.23±1.05*#▲72.86±5.51**#373.34±144.3▲▲

血小板P-選擇素貯存在血小板的顆粒中[4]，正常情況下血小板表面無(wú)P-選擇素表達(dá)或呈持續(xù)低表達(dá)狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞受到刺激后顆粒膜就會(huì)與微管系統(tǒng)的表面融合[5]，導(dǎo)致CD62P分泌到表面，被認(rèn)為是反應(yīng)血小板活化的敏感標(biāo)志之一[6]。血小板的活化通常與代謝率有關(guān)，隨著介質(zhì)中乳酸鹽含量的增加，血小板被活化并釋放α顆粒，進(jìn)一步引起其他血小板的活化。本研究考察血小板活化，采用了CD62p這一目前公認(rèn)的反應(yīng)血小板活化的指標(biāo)。結(jié)果顯示，機(jī)采血小板在保存期間，活化率逐漸上升，尤其在第7天時(shí)，血小板的活化率達(dá)到73%。我國(guó)和美國(guó)血庫(kù)協(xié)會(huì)（AABB）目前規(guī)定機(jī)采血小板22℃振蕩保存時(shí)間為5 d，也與血小板的活化有關(guān)。

S1P是溶血磷脂的中間代謝物，廣泛存在于血液、淋巴液、紅細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、血小板等體液和細(xì)胞中。血小板由于缺乏S1P降解酶類而蓄積S1P，當(dāng)受到凝血酶、鈣離子及血流剪切力等因素刺激時(shí)，血小板活化后釋放S1P到血漿[7]?；谶@一原理，本研究檢測(cè)血小板保存血漿中的S1P濃度，可以間接反映血小板的活化程度。結(jié)果顯示，在血小板保存1～5 d過(guò)程中，血漿中的S1P濃度呈上升趨勢(shì)，說(shuō)明隨著血小板儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)，血小板活化并釋放S1P；在第7天時(shí)，S1P濃度有明顯下降，可能是血漿中存在一些鞘氨醇水解酶，血小板釋放S1P的速率低于血漿中S1P的水解率所致，但具體原因還需要更多的實(shí)驗(yàn)和研究來(lái)進(jìn)一步探究。

綜上所述，本研究的結(jié)果顯示，機(jī)采血小板在22℃震蕩保存過(guò)程中可發(fā)生一系列變化，包括MPV和PDW的升高，PLT的下降，活化率的增加和血漿中S1P濃度的上升。這一系列的變化都提示血小板在保存期間發(fā)生一定程度的活化，甚至凋亡，提示其可能是血小板輸注無(wú)效的原因。在臨床血小板輸注過(guò)程中，對(duì)輸注血小板劑量的判定和輸注效果評(píng)價(jià)時(shí)，應(yīng)考慮到血小板保存過(guò)程中各項(xiàng)指標(biāo)和功能的變化[8]。

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