鹽酸戊乙奎醚對(duì)膿毒血癥大鼠外周血內(nèi)皮細(xì)胞及其微粒計(jì)數(shù)的影響

劉 筍 艾宇航 覃雙全

1.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，湖南長沙 410008；2.湖南省常德市第一人民醫(yī)院急診科，湖南常德 415000

膿毒血癥及序貫發(fā)生的多臟器功能障礙是重癥監(jiān)護(hù)室患者死亡的主要原因。近年來的研究表明，參與膿毒血癥的細(xì)胞中，血管內(nèi)皮細(xì)胞（CECs）非常關(guān)鍵。膿毒血癥時(shí)的CECs在形態(tài)、壽命和功能方面都發(fā)生改變。膿毒血癥時(shí)CECs及微粒（EMPs）數(shù)量升高，且其數(shù)量變化與病情的嚴(yán)重程度及預(yù)后相關(guān)。鹽酸戊乙奎醚是我國具有獨(dú)立知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新一代高選擇性抗膽堿藥物，具有很強(qiáng)的抗膽堿作用，作用全面，持續(xù)時(shí)間長，大量研究顯示在缺血再灌注損傷和圍術(shù)期器官功能保護(hù)上發(fā)揮重要作用。本研究從對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的影響進(jìn)一步探討其保護(hù)作用，為臨床應(yīng)用提供相關(guān)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性 SD 大鼠 120 只，體重（200±70）g，術(shù)前禁食 8 h，禁飲4 h。

1.2 試劑

IL-6、TNF-α試劑盒（武漢博士德生物工程研究所）；基質(zhì)顯色鱟試劑盒（廈門鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠有限公司）；FcRblocking試劑（Miltenyi公司，德國）；Histopaque-1077（Sigma 公司，美國）；PE標(biāo)記的抗人 CD146單克隆抗體，PE標(biāo)記的抗人CD146單克隆抗體（BD公司，美國）。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及處理

隨機(jī)將其分為六組：①生理鹽水對(duì)照組（sham組）：假手術(shù)+生理鹽水 2 mL；②CLP組：CLP+生理鹽水 2 mL；③PHC0.1組：CLP+PHC0.1mg/kg；④PHC0.5組：CLP+PHC0.5mg/kg；⑤PHC1.0組 ：CLP+PHC 1 mg/kg；⑥PHC2.0組：CLP+PHC 2 mg/kg。

1.4 膿毒血癥動(dòng)物模型制備

大鼠經(jīng)腹腔注射2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉后，鈍性分離右側(cè)頸外靜脈，置管備輸液使用。盲腸結(jié)扎穿孔CLP模型[1]，即沿腹部正中切開2 cm腹壁，暴露盲腸，距回盲瓣遠(yuǎn)端結(jié)扎盲腸，結(jié)扎長度為10 mm，然后用18口徑穿刺針單次穿刺被結(jié)扎盲腸，由穿刺孔擠出糞便進(jìn)入腹腔，后將盲腸送回原位，雙層縫合腹壁。假手術(shù)組只切開腹壁再雙層縫合，盲腸不作結(jié)扎穿孔。CLP手術(shù)在10 min內(nèi)完成。所有操作結(jié)束后大鼠保溫靜置3 h。3 h后，PHC0.1組、PHC0.5組、PHC1.0組、PHC2.0組分別經(jīng)右頸外靜脈輸注 0.1、0.5、1.0、2.0 mg/kg（均用生理鹽水稀釋至2 mL）；CLP組及生理鹽水對(duì)照組均輸注生理鹽水2 mL。實(shí)驗(yàn)過程中大鼠直腸溫度維持（37.0±0.5）℃。

1.5 標(biāo)本采集及處理

各組隨機(jī)各取20只觀察CLP或者假手術(shù)術(shù)后6、12、24、48、72 h存活率。各組余下均在行生理鹽水或者鹽酸戊乙奎醚處理后3 h頸外靜脈采血2 mL離心分離血漿和血細(xì)胞，血細(xì)胞用于檢測CECs，血漿用于檢測TNF-α、IL-6和LPS，另取1 mL血液高速離心后，分離血漿，用于EMPs的檢測。

1.6 觀察指標(biāo)

ELISA法檢測血漿TNF-α、IL-6，鱟試劑基質(zhì)終點(diǎn)顯色法測定血漿LPS含量；流式細(xì)胞學(xué)檢測CECs和EMPs，嚴(yán)格按各試劑盒說明書操作。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組生存率比較

各個(gè)時(shí)間點(diǎn)CPL組均較sham組生存率低，而使用鹽酸戊乙奎醚各組間及與CPL組比較，生存率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 見表1。

2.2 血漿TNF-α、IL-6和LPS含量，外周血CECs和EMPs計(jì)數(shù)

各項(xiàng)指標(biāo)CPL組全部高于sham組；TNF-α、IL-6水平和外周血CECs和EMPs計(jì)數(shù)：使用長托寧各組均低于CPL組，長托寧1.0 mg/kg和2.0 mg/kg（兩劑量組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）低于0.1 mg/kg和0.5 mg/kg（兩劑量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）；sham組LPS含量低于所有其他組（P＜0.05），而其他各組間LPS含量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表1 大鼠72 h生存率[n（%），n=20]

表2 血漿TNF-α、IL-6、內(nèi)毒素含量和外周血內(nèi)皮細(xì)胞及其微粒計(jì)數(shù)（±s，n=10）

表2 血漿TNF-α、IL-6、內(nèi)毒素含量和外周血內(nèi)皮細(xì)胞及其微粒計(jì)數(shù)（±s，n=10）

注：與 CPL 組比較，*P ＜ 0.05；與 PHC0.1組比較，﹟P ＜ 0.05；與 PHC0.5組比較，▼P＜0.05

組別 TNF-α（ng/L）IL-6（ng/L）LPS（ng/L）CECs（/105PBMCs）EMPs（個(gè)/mL）sham組CPL組PHC0.1組PHC0.5組PHC1.0組PHC2.0組68±30 291±127 255±120*260±102*156±95*﹟▼129±116*﹟▼34±18 181±102 167±103*170±98*104±73*﹟▼78±75*﹟▼84±37 280±71 267±83*290±64 300±39 258±77 0.84±0.47 48.02±11.07 37.12±13.36*29.70±14.52*20.92±9.08*﹟▼18.83±10.19*﹟▼24±17 278±95 167±93*190±40*103±59*﹟▼108±78*﹟▼

3 討論

膿毒血癥是宿主對(duì)感染的一種全身性反應(yīng)，也是一種死亡率極高的疾病階段。膿毒血癥時(shí)全身內(nèi)皮細(xì)胞（VECs）被激活，對(duì)整個(gè)機(jī)體而言，內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙表現(xiàn)為止血系統(tǒng)失衡、細(xì)胞黏附增加[2]、白細(xì)胞募集、血管舒縮功能改變和喪失屏障作用。CECs及EMPs作為膿毒血癥中VECs功能障礙是重要的細(xì)胞標(biāo)志物。

鹽酸戊乙奎醚是新型選擇性抗膽堿藥物，對(duì)中樞和周圍神經(jīng)均具有很強(qiáng)的抗膽堿作用，作用全面，持續(xù)時(shí)間長，高度選擇性M1、M3受體拮抗作用，而對(duì)M2受體無明顯作用，大量研究顯示在缺血再灌注損傷和細(xì)胞功能保護(hù)上發(fā)揮作用，在圍術(shù)期器官功能保護(hù)方面研究較多；改善微循環(huán)，拮抗炎癥因子及炎癥介質(zhì)，保護(hù)細(xì)胞膜及溶酶體膜，降低毛細(xì)血管通透性等，并在減輕局部炎癥反應(yīng)，緩解心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)方面發(fā)揮作用。

本實(shí)驗(yàn)表明，鹽酸戊乙奎醚能夠有效減輕外周血CECs和EMPs計(jì)數(shù)。膿毒血癥時(shí)機(jī)體促、抗炎介質(zhì)產(chǎn)生及釋放失衡，早期以促炎介質(zhì)的釋放為主，包括TNF-α、IL-1、IL-6和ICAM-1等[3]。大量的實(shí)驗(yàn)研究一致認(rèn)為[4]，TNF-α是膿毒血癥發(fā)病的重要介質(zhì)，是膿毒性休克時(shí)最早釋放且起關(guān)鍵作用的介質(zhì)，它啟動(dòng)膿毒血癥的炎性反應(yīng)，并在發(fā)展過程中起放大作用，即所謂的免疫炎癥的 “瀑布反應(yīng)”。膿毒血癥時(shí)，TNF-α和干擾素可誘導(dǎo)整聯(lián)蛋白α導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞脫落[5]。同時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞合成分泌的白細(xì)胞趨化因子及表達(dá)的黏附因子增加，促進(jìn)白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附，而中性粒細(xì)胞可通過釋放蛋白酶來降解黏連蛋白促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞脫落[6]。本實(shí)驗(yàn)使用PHC后血漿TNF-α、IL-6和LPS水平均降低，由此筆者認(rèn)為PHC通過抑制TNF-α等炎癥因子釋放，從而減少外周血CECs及EMPs計(jì)數(shù)，使內(nèi)皮細(xì)胞受到保護(hù)。具體機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

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