犬細(xì)小病毒自家滅活疫苗的血凝抑制抗體測定

(公安部沈陽警犬技術(shù)學(xué)校，遼寧沈陽 110034)

犬細(xì)小病毒病是由犬細(xì)小病毒感染引起的一種急性傳染病 ,以劇烈嘔吐、出血性腸炎和白細(xì)胞顯著減少為主要特征 ,并可引起犬急性心肌炎,癥狀與貓泛白細(xì)胞減少癥相似 ,是危害我國養(yǎng)犬業(yè)最為嚴(yán)重的傳染病之一。

目前，該病的預(yù)防，國內(nèi)仍傾向于使用CPV滅活苗和弱毒苗。在遼寧地區(qū)發(fā)生細(xì)小病毒病的仔犬病料經(jīng)過電鏡及PCR檢測，發(fā)現(xiàn)疑似細(xì)小病毒變異株，確定變異的基因片段還需進(jìn)一步做病毒分離及細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。目前市售疫苗中無一種能對細(xì)小病毒病起較強(qiáng)的保護(hù)作用。所以，一種特殊的免疫措施—自家滅活疫苗，不失為犬場傳染病流行、緊急狀態(tài)下的緊急控制措施。

自家滅活疫苗就是取發(fā)病犬群中的犬組織，加工做成滅活疫苗。本研究通過對部分仔犬群進(jìn)行自家滅活疫苗免疫，測定免疫后的細(xì)小病毒抗體水平，并通過實(shí)際的免疫效果檢驗(yàn)免疫程序，以指導(dǎo)犬細(xì)小病毒病的控制工作。

1 試驗(yàn)方法

隨機(jī)選擇試驗(yàn)犬30頭，分別在仔犬免疫前、首免后15 d、二免后15 d抽取仔犬血樣，應(yīng)用CPV HA-HI試驗(yàn)診斷技術(shù)對抗體水平進(jìn)行檢測，進(jìn)行免疫效果分析。

2 試驗(yàn)過程

第一步 選擇健康狀況良好、體重相仿的30頭仔犬作為試驗(yàn)犬。隨機(jī)選擇15頭為試驗(yàn)組，注射自家滅活疫苗；另15頭為對照組，注射市售疫苗。

第二步 當(dāng)仔犬達(dá)30日齡時，當(dāng)日清晨前肢靜脈采血2 ml。

第三步 新鮮血液3000 r/min，離心10 min，析出血清。先用PBS液稀釋5倍，并于56℃水浴滅活30 min，待涼。

第四步 配備5 mL/L(0.5%)豬紅細(xì)胞懸液。

第五步 次日，將稀釋后的備用血清加入1/10待檢血清體積的試驗(yàn)用豬紅細(xì)胞，搖勻后室溫吸收(至少)2 h，3000 r/min，離心10 min，取上清液待檢。

第六步 采用微量法在96孔型板上進(jìn)行，用25 μL移液管向第一排的1～9、11、12孔內(nèi)各吸取25 μL混合液移至第2孔，充分吸吹混合，再吸取25 μL混合液移至第3孔，如此循環(huán)到第9孔，最后吸取第9孔的混合液25 μL棄去。第10、11孔不加待檢血清。第12孔滴加25 μL待檢血清。再向1～9孔和11孔中滴加25 μL血凝抗原(含4個HA單位)，10、12孔不加，37℃作用30 min后向1～12孔各滴加50 μL 0.5%豬紅細(xì)胞懸液。所有試驗(yàn)均在2～4℃下進(jìn)行，直至紅細(xì)胞對照清亮，一般4 h后觀察結(jié)果。每一組包括紅細(xì)胞對照、血凝抗原對照和待檢血清對照。

第七步 分別在仔犬首免后15 d、二免后15 d重復(fù)以上操作過程。

3 試驗(yàn)結(jié)果

詳見表1。本試驗(yàn)是對CPV抗體效價的定性測定，一般1∶80是抵抗CPV的保護(hù)效價。

表1 仔犬CPV抗體效價

由表1可見，免疫前，試驗(yàn)組與對照組抗體效價均為1∶80以上，無明顯差異。此后，試驗(yàn)組經(jīng)過二次免疫后效價明顯增高，而對照組顯然疫苗未起作用。

根據(jù)試驗(yàn)，應(yīng)用ELISA方法檢測分析CPV血清效價，結(jié)果表明使用自家滅活苗免疫，短期內(nèi)就能起到對犬細(xì)小病毒的保護(hù)作用。

4 討 論

4.1根據(jù)細(xì)小病毒出現(xiàn)的變異株及目前國內(nèi)外市售疫苗不能有效保護(hù)細(xì)小病毒病之故，使用自家滅活疫苗救急，效果理想。據(jù)試驗(yàn)，自家滅活疫苗主要具有以下優(yōu)點(diǎn)。

一是具有多種抗原成分。由于用于制備自家組織滅活苗的病料采自發(fā)病犬群，其中抗原成分基本包括了本群存在的病原，比較符合免疫保護(hù)與疾病控制要求，較全面的抗原有可能在一定程度上誘導(dǎo)全方位的保護(hù)力，這是—般單苗難以達(dá)到的。

二是犬體組織細(xì)胞成分的特殊作用。這只是一種假設(shè)。自家組織疫苗中的主要成分是犬體組織細(xì)胞，各種病原抗原的含量相比之下是次要的。解剖用過自家組織滅活苗免疫的犬只常能發(fā)現(xiàn)，全身淋巴系統(tǒng)增生，淋巴結(jié)腫大明顯。

三是免疫篩選作用。實(shí)施該免疫措施后，由于大量抗原的引入，犬只機(jī)體處于持續(xù)較強(qiáng)免疫應(yīng)激狀態(tài)，抵抗其它病原或環(huán)境變化的能力降低，于是優(yōu)勝劣汰，加速部分體況差犬、帶毒犬、亞健康犬表現(xiàn)癥狀，從而可盡早識別淘汰，使疾病得到緩解。

4.2多數(shù)仔犬在6～8周齡(最長14周齡)時，母源抗體迅速減少或消失,一般1∶80是抵抗CPV的保護(hù)效價。一般幼犬3周齡內(nèi)很少感染CPV,3周齡后、幼犬母源抗體<1∶80，對CPV最易感。

4.3因CPV對外界理化因素抵抗力較強(qiáng)，糞便中的CPV可存活數(shù)月至百年；并且細(xì)小病毒病具有高度傳染性；40日齡仔犬易感性最強(qiáng)、病死率較高。所以選取仔犬作為研究對象。整個試驗(yàn)過程采用血凝抑制試驗(yàn)，其實(shí)驗(yàn)原理及實(shí)驗(yàn)路線非常成型。根據(jù)細(xì)小病毒具有較強(qiáng)的血凝活性，在4℃和25℃均能凝集豬紅細(xì)胞這一特性。但血凝可受很多外在條件的影響(溫度影響)，因此在具體實(shí)驗(yàn)中，必須探索出血凝可獲得高滴度結(jié)果的溫度條件。