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    基于氧化石墨烯淬滅效應(yīng)的DNA傳感器特異性檢測三聚氰胺

    2012-10-16 06:23:42王麗華樊春海
    核技術(shù) 2012年5期
    關(guān)鍵詞:三聚氰胺特異性光譜

    李 靜 裴 昊 李 凡 王麗華 樊春海

    (中國科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所 上海 201800)

    三聚氰胺(C3H6N6, Melamine, Mel)是廣泛應(yīng)用于塑料工程和農(nóng)業(yè)的原料。近年來,三聚氰胺在食品中的違規(guī)添加造成嚴重后果,引起人們的普遍關(guān)注[1,2]。C3H6N6是含氮量很高的三嗪類雜環(huán)化合物,每1 kg牛奶中添加0.1 g三聚氰胺,就能提高0.4%的蛋白質(zhì)含量。常規(guī)的凱氏定氮法等全氮測定法無法檢測出三聚氰胺,故曾在牛奶和奶粉里過度添加[3,4]。三聚氰胺進入體內(nèi)會損害生殖、泌尿系統(tǒng),如膀胱、腎部結(jié)石,并可進一步誘發(fā)膀胱癌?,F(xiàn)有檢測方法如氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)、高效液相色譜(HPLC)、表面增強拉曼光譜(SERS)、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/ MS)等有較高靈敏度,但它們均系大型精密儀器、對實驗環(huán)境及操作人員要求較高、檢測時間過長,限制了它們在實際檢測中的應(yīng)用[5–7]。

    本文提出一種快速檢測方法,其基于氧化石墨烯(graphene oxide, GO)的淬滅效應(yīng)。GO是新型的納米材料,其獨特的物理化學(xué)和光學(xué)性質(zhì),在生物傳感方面的應(yīng)用十分廣泛[8–10]。研究表明,GO可吸附單鏈DNA形成GO-DNA復(fù)合物,并有效淬滅DNA標記染料(如 Fam)的熒光[11–13]?;谌矍璋分辛h(huán)的平面結(jié)構(gòu),推測它可與GO表面發(fā)生較強作用。三聚氰胺的加入導(dǎo)致其與DNA在GO表面發(fā)生競爭,DNA從GO表面脫落進入溶液中,熒光得以恢復(fù)。具體為選擇一段長度為15 bp、Fam標記的單鏈DNA序列,通過與GO的吸附形成GO-DNA復(fù)合探針,此時Fam-DNA的熒光被有效淬滅。加入三聚氰胺后,熒光得到恢復(fù)。圖1為GO-DNA傳感器檢測三聚氰胺示意圖。

    圖1 基于GO/Fam-DNA的傳感器檢測三聚氰胺Fig.1 The principle of Melamine detection with the GO/Fam-DNA sensor.

    1 材料和方法

    1.1 試劑與儀器

    三聚氰胺溶液的配制:取21 mg粉末溶于1 mL 20%的甲醇/水溶液中,終濃度為 167 mmol/L;Fam-DNA 序列為 Fam-TGCGAACCAGGAATT(上海英濰捷基貿(mào)易有限公司,HPLC純化),用Milli Q水制成10 μmol/L的母液備用;GO依據(jù)文獻[14–16]合成;1×PBS、麥芽糖、葡萄糖、果糖(上海生工生物工程有限公司);F-4500熒光分光光度計(Hitachi,日本);熒光比色皿(宜興市玻璃器皿廠)。

    1.2 驗證氧化石墨烯與Fam-DNA的相互作用

    取5 μL濃度為10 μmol/L的Fam-DNA,置于995 μL 的 1×PBS 緩沖液(100 mmol/L NaCl,10 mmol/L PB,pH 7.4)中混勻,將比色皿放入熒光分光光度計中,設(shè)置參數(shù)為激發(fā)波長為494 nm,發(fā)射波長范圍為504–650 nm[17–20],電壓為950 V,狹縫寬度為5 nm,記錄Fam-DNA(終濃度50 nmol/L)的熒光光譜。然后向比色皿中加入 5 μL GO(0.47 mg/mL),混勻后再次記錄熒光光譜。通過比較加入GO前后熒光光譜的變化,驗證GO與Fam-DNA之間的相互作用以及GO-DNA復(fù)合物是否形成。

    1.3 三聚氰胺的特異性和靈敏度研究

    在含有50 nmol/L Fam-DNA、5 μL GO的1 mL溶液中,加入不同體積的三聚氰胺(167 mmol/L),并使終濃度分別為0、0.0668、0.668、1.34、2.00、3.34、4.66、6.68、10.02、13.36、20.04 mmol/L,記錄熒光光譜,考察三聚氰胺的的檢測范圍和檢測限。在特異性分析中,選擇了0.0668 mmol/L三聚氰胺和10 mmol/L的葡萄糖、麥芽糖、果糖進行分析,考察其特異性。

    2 結(jié)果

    2.1 GO-DNA傳感器檢測三聚氰胺

    圖2為DNA、GO-DNA以及GO-DNA/Mel的熒光光譜圖。

    圖2 DNA、GO-DNA以及GO-DNA/Mel的熒光光譜圖Fig.2 The fluorescence spectra of DNA, GO-DNA and GO-DNA/Mel.

    50 nmol/L Fam-DNA的熒光光譜圖在波長525 nm處熒光值為2431(■)。此時,加入三聚氰胺,熒光值略升高,變化不大(★)。當加入5 μL GO(0.47 mg/mL)后,熒光值迅速下降至103(●),淬滅效率達95.8%。結(jié)果說明,F(xiàn)am-DNA被吸附到GO表面,并拉近了Fam與GO的距離,導(dǎo)致熒光被GO有效淬滅,該現(xiàn)象與文獻[21–23]報道一致。而加入13.36 mmol/L三聚氰胺后,三聚氰胺將 GO表面的Fam-DNA 取代,熒光值重新升至 1685(▲),上升16.4倍。該數(shù)據(jù)有效地證實了當GO與Fam-DNA距離較近時,GO可以淬滅Fam-DNA熒光,使熒光值迅速下降;而三聚氰胺能夠取代 GO表面的Fam-DNA,使Fam-DNA與GO距離變大,熒光值升高;所以,通過熒光值的變化可以檢測三聚氰胺,即用GO-DNA傳感器檢測三聚氰胺的方法可行。

    2.2 三聚氰胺檢測的特異性和靈敏度分析

    為證明三聚氰胺檢測方法的特異性,我們進行了空白分析和對照分析,對三聚氰胺、三種對照樣品及空白對照結(jié)果見圖3,其縱坐標為加入樣品前后的熒光增加值ΔF=F–F0。由圖3可見,10 mmol/L麥芽糖(Mal)、葡萄糖(Glu)和果糖(Fru)的加入導(dǎo)致熒光值有小幅升高,說明它們與GO的相互作用較弱,只有少量的DNA分子從GO表面脫落。而0.0668 mmol/L三聚氰胺的加入導(dǎo)致熒光值升高了143,信噪比為10左右,表明三聚氰胺與GO表面存在著強相互作用。這種GO與三聚氰胺的獨特作用,很易區(qū)分三聚氰胺與其它分析物,實現(xiàn)特異性檢測。

    圖3 GO-DNA傳感器特異性檢測三聚氰胺Fig.3 Selectivity of melamine detection by the GO-DNA sensor.

    圖4給出了基于GO/Fam-DNA的傳感器在檢測不同濃度三聚氰胺的熒光變化情況。在含有Fam-DNA和GO的檢測體系中,加入不同濃度的三聚氰胺(0、0.0668、0.668、1.34、2.00、3.34、4.68、6.68、10.02、13.36、20.04 mmol/L)。由圖4(a),熒光值隨三聚氰胺濃度而升高,到13.36 mmol/L時達到最高。對熒光值與三聚氰胺濃度進一步進行分析,三聚氰胺的線性檢測范圍為0.0668–1.336 mmol/L,最低檢測到 6.68×10–5mol/ L 三聚氰胺(圖4b)。檢測三聚氰胺的其它方法檢測限:ELISA(免疫檢測法)最低檢測限為1 μg/mL,但復(fù)雜,檢測時間長,不如本方法簡便、快速。

    綜上所述,利用 GO-DNA傳感器檢測三聚氰胺,具有很好的特異性和靈敏度,整個檢測過程簡便快速,適合大批量樣品的現(xiàn)場分析。

    圖4 基于GO-DNA的傳感器檢測不同濃度三聚氰胺Fig.4 GO-DNA based sensor for detection of various concentrations of melamine.

    3 結(jié)語

    “三鹿奶粉事件”等類似事件的發(fā)生對三聚氰胺的檢測提出了更高的要求[18]。本工作提出了一種基于GO-DNA的檢測方法,并實現(xiàn)了三聚氰胺的快速、靈敏檢測。該方法主要是基于GO與Fam-DNA、三聚氰胺的相互作用差異,并通過 DNA和三聚氰胺在GO表面的競爭吸附來實現(xiàn)三聚氰胺的檢測。與傳統(tǒng)方法相比,基于GO的熒光檢測方法具有以下優(yōu)點:(1) 操作簡便,對檢測人員技能及檢測環(huán)境要求不高;(2) 不需要大型精密儀器,成本低;(3)分析時間短,可以快速得到實驗結(jié)果;(4) 特異性高,可以特異性檢測三聚氰胺,因此檢測樣品不需要復(fù)雜的前處理,可以直接檢測,節(jié)省分析時間;(5) 靈敏度較好,可以檢測 0.0668 mmol/L三聚氰胺;(6) 檢測精確度高,重復(fù)性好;(7) 實用性好,該方法可用于實際樣品的檢測。 因此,GO-DNA傳感器可以快速、準確、特異地檢測三聚氰胺,是一種有效檢測三聚氰胺的新方法。

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