一株雞呼吸型傳染性支氣管炎病毒的分離鑒定

李曉峰,鄭振宇,楊紅瑞,許保疆,張怡磊

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院,河南鄭州450002；2.鄧州市勞動就業(yè)訓(xùn)練中心,河南鄧州474150；3.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院,河南鄭州450002；4.鄧州市畜牧局,河南鄧州474150）

雞傳染性支氣管炎（infectious bronchitis,IB）是由傳染性支氣管炎病毒（infectious bronchitis virus,IBV）所致的一種急性、高度接觸性傳染病,主要侵害雞的呼吸系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)和消化系統(tǒng)[1].目前,雞傳染性支管炎的臨床分型主要包括呼吸型、生殖型（又稱產(chǎn)蛋雞變異型）、腎型、腺胃型等,此病是養(yǎng)雞業(yè)中常見的、危害嚴(yán)重的傳染病之一[2].呼吸型傳染性支氣管炎是雞傳染性支氣管炎的一種病理表現(xiàn)形式.近幾年來,呼吸型傳染性支氣管炎在我國蛋雞群中廣泛流行,給養(yǎng)雞生產(chǎn)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失[3].IB主要見于20～50日齡的仔雞,表現(xiàn)為突然發(fā)病,迅速傳播,特征性癥狀是糞便中白色尿酸鹽成分增加,死亡率為5%～30%.雞傳染性支氣管炎病毒是冠狀病毒科冠狀病毒屬的一個代表種,該病毒主要存在于病雞呼吸道滲出液中,主要傳播方式是經(jīng)呼吸道感染,也可通過消化道傳播.雞感染呼吸型傳染性支氣管炎的主要病變特征是腎臟腫大,呈花斑型[4].1972年在廣東省有傳染性支氣管炎存在,隨后絕大多數(shù)省份相繼發(fā)生該病,在此期間發(fā)生的傳染性支氣管炎也主要為呼吸型.20世紀(jì)90年代以來,呼吸型傳染性支氣管炎在國內(nèi)曾經(jīng)相繼爆發(fā).近幾年來,雞呼吸型傳染性支氣管炎的發(fā)病率逐年增加,死亡率較高,80%商品蛋雞發(fā)病后會影響產(chǎn)蛋率[5].此外,該病的高度傳染性和病原多血清型性,使得免疫預(yù)防復(fù)雜化并增加費用.感染雞生長受阻,耗料增加,產(chǎn)蛋和蛋質(zhì)下降、死淘率增加,并繼發(fā)感染氣囊炎,導(dǎo)致肉雞加工過程中的廢棄.因此,本病常給養(yǎng)雞業(yè)造成極大的經(jīng)濟損失[6].

1 材料與方法

1.1 試驗時間和地點

本試驗于2012年3月至4月間在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)禽病研究所進行.

1.2 試驗動物

2012年3月,新鄭市某雞場36日齡蛋雞發(fā)病,臨床表現(xiàn)為呼吸困難,精神沉郁,采食量下降,拉白色水樣稀便,病初零星死亡,幾天后死亡率逐漸增加.病理剖解可見呼吸道粘膜出血充血,腎臟腫大呈“花斑腎”.根據(jù)臨床、病理剖解結(jié)果分析,懷疑病雞感染呼吸型傳染性支氣管炎而發(fā)病,采取病雞肺、氣管組織,保存?zhèn)溆?

試驗用9～11日齡的SPF雞胚和5日齡SPF雛雞購自北京梅里亞動物保健公司.

1.3 試驗主要儀器及藥品

SW-CJ-2G.37雙人凈化操作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）,HG303-4恒溫箱（南京實驗儀器廠）.

胰蛋白酶購自鄭州億諾化工有限公司,工作濃度為1.5%；NDV LaSota株購自哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司；雞紅細胞采自SPF雞,工作濃度為1.0%；青霉素和鏈霉素購自華北制藥股份有限公司,工作濃度為1 000 IU.

1.4 操作過程和方法

1.4.1 病毒分離 病料采集與無菌處理,取臨床表現(xiàn)呼吸困難、病理剖檢表現(xiàn)為腎腫大呈“花斑腎”的病死蛋雞氣管和肺臟組織,在無菌操作臺上剪碎,加入滅菌生理鹽水,按1∶5稀釋后研磨制成懸液,每mL加入青霉素1 000 IU和鏈霉素1 000 IU,4℃處理1.5～3 h,然后反復(fù)凍融3次后,按照3 000 r/min離心5 min,取上清液接種8枚9～11日齡SPF雞胚尿囊腔,0.2 mL/胚,用石蠟封住注射部位,并標(biāo)注日期和時間（見圖1、圖2）.然后將其放置于37℃溫箱.每天照蛋2次,將死胚放置于4℃冰箱過夜,棄去24 h內(nèi)死胚,收取48～72 h內(nèi)死胚尿囊液（見圖3）.死胚尿囊液接種另一組雞胚,未死雞胚至接種120 h后置4℃冰箱凍死,觀察雞胚病變,連續(xù)盲傳5代[7].

圖1 接種Fig.1 Vaccination

圖2 封口 Fig.2 Seal

圖3 收集尿囊液Fig.3 Collect allantoic fluid

1.4.2血凝特性試驗 取第3代SPF雞胚尿囊液,經(jīng)3 000 r/min離心5 min后,將上清液分為2份,其中1份按終濃度加入1.5%的胰蛋白酶,另1份不作任何處理,同時用滅菌生理鹽水按同樣方法處理作為對照.37℃水浴2 h后,常規(guī)微量法測定病毒的紅細胞凝集價,以出現(xiàn)100%凝集的病毒最大稀釋倍數(shù)作為該樣品的紅細胞凝集價[8].

1.4.3 雞胚矮小化試驗 取10枚10日齡SPF雞胚平均分為2組.試驗組取第1代死亡雞胚尿囊液,經(jīng)尿囊腔接種5枚,每胚接種0.2 mL,連續(xù)傳代,同時設(shè)對照組用滅菌生理鹽水接種,觀察雞胚死亡情況[9].

1.4.4 雞新城疫干擾試驗 將10日齡SPF雞胚分A、B、C、D共4個組,每組5枚：A組,取分離株第3代SPF雞胚尿囊液經(jīng)尿囊腔接種雞胚,每胚0.2 mL,37℃孵化10 h后復(fù)種NDV LaSota株,每胚0.2 mL；B組,將分離株第3代SPF雞胚尿囊液和NDVLaSota株同時經(jīng)尿囊腔接種雞胚,每枚0.2 mL；C組,將NDV LaSota株經(jīng)尿囊腔接種雞胚,每枚0.2 mL；D組,無菌生理鹽水經(jīng)尿囊腔接種雞胚,每枚0.2 mL,作為陰性對照.以上各組雞胚置37℃繼續(xù)孵化72 h后,4℃凍死雞胚,無菌收集尿囊液,常規(guī)微量法進行血凝試驗,以出現(xiàn)100%凝集的病毒最大稀釋倍數(shù)作為該樣品的紅細胞凝集價[10].

1.4.5 瓊脂凝膠擴散試驗 按照常規(guī)方法制作瓊脂板、打孔,然后加入IB抗原和血清.按照常規(guī)方法制作瓊脂板、打孔,然后加入抗原和血清中央孔7加入標(biāo)準(zhǔn)陽性血清.1、4孔加入標(biāo)準(zhǔn)瓊擴抗原,2、3、5、6孔各加入發(fā)病雞血清,添加至孔滿為止,待孔中液體吸干后將平皿倒置,放在濕盒內(nèi),置37℃溫箱24～72 h,逐日觀察3 d,并記錄結(jié)果.

1.4.6 RT-RCR試驗 RT-PCR驗證引物設(shè)計參照Zwaagstra等的報道,按照TRizol RNA提取試劑盒的方法從分離病毒第5代尿囊液中提取病毒RNA,隨后進行RT-PCR、電泳試驗,并設(shè)陽性尿囊液對照[11].在電鏡下觀察并拍照.

1.4.7 動物回歸試驗 將20羽15日齡非免疫蛋雞,隨機分為2組,每組10羽,分為人工感染組（A組）和正常對照組（B組）,分籠隔離飼養(yǎng).將分離株第5代SPF雞胚尿囊液分別經(jīng)口、鼻、眼接種A組雞,每羽0.2 mL；B組雞經(jīng)相同途徑接種等量滅菌生理鹽水.之后每天觀察各組雞的臨床表現(xiàn),對病死雞進行剖檢,并記錄病理變化.

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒分離

病料采集與無菌處理后,經(jīng)雞胚連續(xù)盲傳5代,獲得了1株病毒.

2.2 血凝試驗結(jié)果

血凝試驗顯示分離株尿囊液血凝價為零,經(jīng)1.5%胰蛋白酶處理后血凝價為7ln2,對照胚尿囊液經(jīng)處理后血凝價為3ln2（見表1）.結(jié)果表明,該病毒本身不能凝集紅細胞,但經(jīng)過1.5%胰蛋白酶處理后能夠使紅細胞發(fā)生凝集.

表1 分離株IBV的HA價測定結(jié)果Tab.1 The HA price determination resulte of the isolates of IBV

2.3 雞胚矮小化試驗結(jié)果

病變組織處理后,經(jīng)雞胚尿囊液接種10日齡SPF雞胚,在初次傳代時,胚體表現(xiàn)輕度出血,但是支氣管沒有肉眼可見的病變.在盲傳3～5代后,雞胚生長發(fā)育明顯受到抑制,出現(xiàn)侏儒胚、蜷曲胚或者畸形胚等現(xiàn)象（見圖4）.有的胚體呈彌漫性出血,尤其是頭部出血比較明顯.羊膜增厚,卵黃囊皺縮,部分雞胚尿囊液有白色尿酸鹽結(jié)晶.

圖4 對照胚（左）及侏儒胚（右）Fig.4 The control embryo（left）and dwarfembryos（right）

2.3 雞新城疫干擾試驗

結(jié)果顯示分離株接種雞胚10 h后復(fù)種NDV,可明顯干擾NDV在雞胚中的增殖；如果兩種病毒同時接種雞胚,則對NDV在雞胚中的增殖影響不大（見表2）.

表2 經(jīng)IBV干擾后的NDV的HA價測定結(jié)果Tab.2 The HA price determination results ofNDV after the interference by IBV

2.4 瓊脂凝膠沉淀試驗

結(jié)果顯示,在標(biāo)準(zhǔn)陽性血清與標(biāo)準(zhǔn)抗原孔之間形成致密沉淀線,并與陽性對照沉淀線平滑相連（見圖5）,表明該試驗結(jié)果為陽性.

2.5 RT-PCR試驗

由電泳試驗結(jié)果顯示本試驗提取的病毒為IBV陽性,即該病毒為雞呼吸傳染性支氣管炎病毒（見圖 6）.

圖5 瓊脂擴散試驗Fig.5 Agar diffusion test

圖6 右3為陽性對照Fig.6 The control group in the third of right

2.6 動物回歸試驗

A組10羽雞于攻毒后3 d,雞群開始出現(xiàn)喘氣和氣管噦音（見圖7）,隨后表現(xiàn)精神萎頓、食欲不振、拉白色稀糞、嗜睡等臨床癥狀,接種后6 d死亡2羽,接種后10 d死亡3羽.剖檢病死雞,均見腎臟腫大、色白,輸尿管和腎小管內(nèi)充滿白色尿酸鹽并呈菜花狀（見圖8）.早期病死雞的氣管內(nèi)和肺部充血、出血和少量黏液.對照組一切正常.說明分離株可引起雛雞發(fā)病,早期主要侵害雛雞的呼吸系統(tǒng),中后期則主要侵害雛雞的泌尿系統(tǒng),這符合呼吸型傳染性支氣管炎病毒的感染特征.

圖7 呼吸困難 Fig.7 Difficulty in breathing

圖8 腎臟腫大,有尿酸鹽沉積,呈“花斑腎”Fig.8 Kidney enlargement,urate deposition is“spotted kidney”

3 結(jié)論

本試驗從疑似呼吸型傳染性支氣管炎（IB）死雞氣管和肺臟組織中成功分離到一株病毒,經(jīng)雞胚傳代,到第3代,出現(xiàn)卷縮胚,第5代,卷縮胚達到50%.第3～5代的尿囊液經(jīng)1.5%胰蛋白酶處理后對雞紅細胞可引發(fā)凝集.瓊脂凝膠擴散試驗中,病毒分離得到的第3～5代雞胚尿囊液與呼吸型IBV抗血清均可形成沉淀線,其沉淀線與腎型IBV陽性抗原和呼吸型IBV抗血清之間形成的沉淀線發(fā)生完全融合[12].該分離株在雞胚病毒干擾試驗中對NDV LaSota株的增殖有顯著干擾作用[13].動物回歸試驗,試驗雞感染分離毒株,發(fā)病率達100%,死亡率達50%,死雞的病理變化明顯而典型.結(jié)果表明,該分離毒株是雞呼吸型IBV[14].

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