南陽黃牛CD14基因擴(kuò)增及序列分析

馬蓓蓓，龍 塔，薛 云，周 峰，趙戰(zhàn)勤

(河南科技大學(xué) a.動(dòng)物科技學(xué)院;b.醫(yī)學(xué)技術(shù)與工程學(xué)院，河南洛陽471003)

0 前言

牛白細(xì)胞分化抗原14(CD14)是一種存在于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞表面的分化抗原。CDl4是一種模式識(shí)別受體蛋白，它能識(shí)別多種革蘭氏陽性菌和陰性菌的細(xì)胞壁成分，如磷酸脂多糖、肽聚糖等，將其傳遞給Toll樣受體蛋白，激活單核巨噬細(xì)胞，引起一系列炎癥促進(jìn)因子和炎癥抑制因子的表達(dá)。因此，CD14是天然免疫系統(tǒng)的重要成分之一，是啟動(dòng)和介導(dǎo)病原微生物抗原信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)鍵分子，與多種傳染病的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)［1-3］。CD14對(duì)研究感染與免疫的發(fā)生機(jī)理意義重大。南陽黃牛是分布在南陽地區(qū)的地方特有品種，是中國五大良種之一，且是分布最廣的品種。南陽黃牛肉質(zhì)好，生產(chǎn)周期短，其抗病性尤其引人關(guān)注［4］，研究表明:南陽黃牛對(duì)如結(jié)核病等傳染病的抵抗力遠(yuǎn)優(yōu)于奶牛，但其遺傳分子機(jī)制未明。近些年來，國際上已在DNA水平上對(duì)奶牛進(jìn)行了一些研究，主要涉及到奶牛的分子群體遺傳特征及起源進(jìn)化、經(jīng)濟(jì)性狀分子遺傳標(biāo)記及相關(guān)功能基因多態(tài)性研究等［5］。但對(duì)南陽黃牛的基因研究仍鮮見報(bào)道。CD14是重要的病原微生物識(shí)別受體蛋白，但南陽黃牛CD14基因的生物學(xué)信息分析還從未有過詳盡研究。

本文通過擴(kuò)增南陽黃牛CD14基因完整編碼區(qū)和近端非編碼區(qū)，對(duì)基因結(jié)構(gòu)及其編碼的氨基酸進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，了解中原地區(qū)南陽黃牛CD14基因的生物信息學(xué)特點(diǎn)，獲得的參數(shù)為今后研究南陽黃牛的抗病性提供試驗(yàn)依據(jù)，也為進(jìn)一步的群體遺傳學(xué)的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

采用南陽黃牛中心產(chǎn)區(qū)典型群隨機(jī)抽樣的方法在河南省南陽地區(qū)采集黃牛血樣。頸靜脈采血10 mL，用ACD抗凝劑1∶6(體積比)抗凝，-70℃冰箱凍存［6］。用鹽析法進(jìn)行基因組DNA的提取。

1.2 主要試劑和儀器

基因組提取試劑盒、Taq DNA聚合酶、dNTPs、D16000-DNA Marker及有關(guān)緩沖液等均購自上海Sagon公司。GeneAmp PCR儀、Tanon 1600凝膠成像系統(tǒng)、北京市六一儀器廠DYY-10C型電泳儀等。

1.3 引物序列設(shè)計(jì)

參照GenBank上已發(fā)表的荷斯坦奶牛的CD14基因序列(登錄號(hào):D84509.1)，使用Premier5.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增CD14基因編碼區(qū)的引物，分4段擴(kuò)增，引物由上海Sagon公司合成，序列見表1。

1.4 PCR擴(kuò)增

PCR 反應(yīng)體系為 30 μL，包括:3 μL 10 × PCR Buffer，1 μL Taq 酶，2 μL MgCl2，10 μmol的上下游引物各 1 μL，1 μL 模 板 DNA，2μL dNTPs，然后加滅菌雙蒸水 19 μL 至30 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性 30 s，58.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸 50 s，30 個(gè)循環(huán)，最后72℃總延伸10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物通過1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠電泳鑒定后進(jìn)行序列測(cè)定(由上海Sagon公司完成)。

1.5 序列的分析與結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用DNAstar軟件將擴(kuò)增的序列與GenBank上已發(fā)表的荷斯坦奶牛、水牛、豬、山羊、綿羊、人、獼猴、大猩猩、小鼠的CD14基因序列進(jìn)行同源性比較，制作進(jìn)化樹;用NCBI中的ORF Finder軟件進(jìn)行開放閱讀框的識(shí)別，翻譯成氨基酸序列;TMHMM Server v.2.0預(yù)測(cè)跨膜結(jié)構(gòu)［7］。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1 南陽黃牛CD14基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

電泳結(jié)果表明PCR產(chǎn)物特異性良好(見圖1)。4段產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為:1 578 bp(見圖1a)，832 bp(見圖1b)、825 bp(見圖1c)、747 bp(見圖1d)，電泳結(jié)果與預(yù)期片段大小相符。

圖1 CD14基因PCR擴(kuò)增

2.2 南陽黃牛CD14基因測(cè)序結(jié)果和氨基酸序列推導(dǎo)

CD14基因PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，送生物公司進(jìn)行DNA測(cè)序。拼接4段擴(kuò)增片段結(jié)果，獲得牛CD14基因的完整序列。堿基組成的含量分別為 A(18.4%)、T(18.4%)、C(32.9%)、G(30.2%)。通過NCBI的ORF Finder軟件進(jìn)行開放閱讀框的識(shí)別，得到南陽黃牛的CD14基因編碼區(qū)共966 bp，與GenBank已公布的荷斯坦奶牛CD14基因序列(登錄號(hào):D84509.1)比較，有2個(gè)堿基突變;5’端非編碼序列長(zhǎng)度為1 543 bp，發(fā)生了2個(gè)堿基突變;3’端非編碼序列長(zhǎng)460 bp，發(fā)生了5個(gè)堿基突變(見表2)。南陽黃牛CD14基因核苷酸共編碼321個(gè)氨基酸，與荷斯坦奶牛相比，南陽黃牛位于編碼區(qū)的2個(gè)DNA突變并沒有引起氨基酸序列的改變。

表2 南陽黃牛與荷斯坦奶牛CD14基因核苷酸序列的比對(duì)結(jié)果

2.3 南陽黃牛CD14基因的同源性比對(duì)

通過MegAlign軟件得到南陽黃牛CD14基因的序列與GenBank中荷斯坦奶牛、水牛、綿羊、山羊、豬、獼猴、大猩猩、人、小鼠的同源性分別為 99.8%、98.2%、96.8%、92.8%、83.5%、79.8%、79.7%、79.5%、71.9%，如圖2所示。

2.4 南陽黃牛CD14進(jìn)化樹構(gòu)建

利用DNAStar中的MegAlign軟件對(duì)物種間的系統(tǒng)發(fā)生樹進(jìn)行構(gòu)建(見圖3)。系統(tǒng)發(fā)生樹總體分為兩支，小鼠單獨(dú)為一支，南陽牛、荷斯坦奶牛、水牛、豬、山羊、綿羊、人、獼猴、大猩猩為另一獨(dú)立的大支。南陽黃牛與荷斯坦奶牛聚在一起，再與水牛聚為一類，山羊和綿羊先聚在一起，再與南陽牛、荷斯坦奶牛、水牛聚為一類，然后再與豬聚為一類。人和猩猩先聚在一起，再與獼猴聚為一類，然后再與南陽牛、荷斯坦奶牛、水牛、山羊、綿羊和豬共同聚為一支。

2.5 南陽黃牛CD14跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

通過TMHMM Server v.2.0在線分析發(fā)現(xiàn)CD14蛋白沒有跨膜結(jié)構(gòu)域，見圖4。

圖2 南陽黃牛與其他動(dòng)物的CD14基因同源性比較

圖3 南陽黃牛CD14基因進(jìn)化樹

圖4 南陽黃牛CD14跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析圖

3 討論

參照GenBank上已發(fā)表的荷斯坦奶牛的CD14基因序列(登錄號(hào):D84509.1)，設(shè)計(jì)了4對(duì)引物，擴(kuò)增了涵蓋南陽黃牛CD14基因非編碼區(qū)和完整編碼區(qū)的目的片段，之后進(jìn)行序列測(cè)定和拼接，成功獲得了CD14基因的全部序列。通過NCBI的ORF Finder軟件進(jìn)行開放閱讀框的識(shí)別，得到南陽黃牛CD14基因開放閱讀框全長(zhǎng)966 bp，共編碼321個(gè)氨基酸。堿基組成為A(18.4%)、T(18.4%)、C(32.9%)、G(30.2%)。A+T的含量(36.8%)顯著低于G+C含量(63.1%)，這一模式與水牛、野牛等其他品種的牛CD14基因相似，但與其他動(dòng)物具有一定差異［8］。

在南陽黃牛CD14基因的5’端發(fā)現(xiàn)了長(zhǎng)1 543 bp的非編碼區(qū)，與已發(fā)表的荷斯坦奶牛CD14基因序列相似度很高［9］，經(jīng)比對(duì)有2個(gè)接近編碼區(qū)的堿基發(fā)生突變;南陽黃牛CD14基因的編碼區(qū)966 bp，與荷斯坦奶牛相比發(fā)生了2個(gè)堿基突變;在3’端也發(fā)現(xiàn)了一段較長(zhǎng)的非編碼區(qū)，長(zhǎng)460 bp，與荷斯坦奶牛對(duì)比發(fā)生了5個(gè)堿基突變。盡管發(fā)現(xiàn)數(shù)個(gè)堿基突變，南陽黃牛CD14氨基酸序列與荷斯坦奶牛完全一致。通過TMHMM Server v.2.0分析發(fā)現(xiàn)南陽黃牛CD14基因編碼的氨基酸序列沒有跨膜結(jié)構(gòu)域(見圖4)，驗(yàn)證了CD14確屬細(xì)胞表面糖蛋白家族成員之一，可能作為一種特異性的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記物，在機(jī)體免疫、防御系統(tǒng)引起的一系列病理反應(yīng)中起關(guān)鍵作用［10］。

通過MegAlign軟件將南陽黃牛CD14基因的序列與GenBank中荷斯坦奶牛、水牛、豬、山羊、綿羊、人、獼猴、大猩猩、小鼠等物種同源核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果表明:南陽黃牛與荷斯坦奶牛的同源性最高，達(dá)到99.8%，與水牛、綿羊和山羊的同源性較高，分別為98.2%、96.8%、92.8%，由此證明了CD14基因在反芻動(dòng)物間的高度保守性。由圖3進(jìn)化樹分析圖表明:南陽黃牛與荷斯坦奶牛、水牛、綿羊、山羊、豬、獼猴、大猩猩、人、小鼠的親緣關(guān)系依次變遠(yuǎn)。與豬、獼猴、大猩猩、人的同源性分別為83.5%、79.8%、79.7%、79.5%，與小鼠同源性最低，僅為71.9%。通過MegAlign構(gòu)建的進(jìn)化樹(見圖3)可以看出:各物種的分化與物種進(jìn)化規(guī)律一致，牛和羊同為反芻類動(dòng)物，因此聚為一支，而人與大猩猩和獼猴同為靈長(zhǎng)類動(dòng)物，因此聚為一支，符合物種遺傳距離遠(yuǎn)近的實(shí)際情況。

CD14基因系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系上與各物種間的親緣關(guān)系密切，說明了該基因在物種進(jìn)化過程中保守性很高，在動(dòng)物生命活動(dòng)中起到很重要的作用［11］。本試驗(yàn)再一次證明了CD14基因在反芻動(dòng)物之間進(jìn)化過程中保守性很高，從而可以推測(cè)反芻動(dòng)物CD14基因轉(zhuǎn)錄、翻譯及其作用機(jī)制等都可能是相似的。另外，研究還發(fā)現(xiàn)不同物種間的牛CD14基因序列存在一定程度的差異。結(jié)合牛CD14基因的功能來推測(cè)，這可能與不同物種的遺傳差異性、生長(zhǎng)環(huán)境等都有很大的關(guān)系。

目前，對(duì)人CD14基因的結(jié)構(gòu)和功能研究已經(jīng)比較深入，在細(xì)菌、病毒、真菌感染以及抗腫瘤作用方面表現(xiàn)出巨大的應(yīng)用前景［2，12-13］。但是對(duì)于牛CD14基因的研究方面，僅有國外少量報(bào)道，尤其對(duì)中國南陽黃牛這一中原地區(qū)主要地方品種的研究更為鮮見。本文對(duì)南陽黃牛CD14基因進(jìn)行了擴(kuò)增和序列分析，為研究南陽黃牛抗病性強(qiáng)的分子機(jī)制，與其他牛種的分子遺傳學(xué)差異，為中國進(jìn)一步開發(fā)、應(yīng)用南陽黃牛優(yōu)秀的品種資源打下了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

利用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)南陽黃牛CD14基因的核苷酸和推導(dǎo)氨基酸序列進(jìn)行了分析和預(yù)測(cè)，初步了解該基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，這對(duì)于進(jìn)一步開展南陽黃牛CD14分子的結(jié)構(gòu)功能、揭示病原微生物入侵宿主的致病機(jī)制以及設(shè)計(jì)免疫預(yù)防控制技術(shù)和抗病育種策略等方面都有重要的理論價(jià)值。

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