• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    絮凝劑產(chǎn)生菌絮凝活性分布及其發(fā)酵條件優(yōu)化

    2012-10-13 02:38:18劉清太王永澤王金華
    關(guān)鍵詞:絮凝劑氮源發(fā)酵液

    劉清太,裴 璐,付 剛,王永澤,王金華

    (1山東濰坊盛泰藥業(yè)有限公司,山東 濰坊262400;2湖北工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院,湖北 武漢430068)

    傳統(tǒng)的無機(jī)鹽絮凝劑和有機(jī)高分子絮凝劑(如氯化鋁、聚丙烯酰胺等)在完成污水處理處置工藝后很容易造成水質(zhì)的二次污染,對(duì)人體都有毒害作用[1].微生物絮凝劑是一類由微生物產(chǎn)生的可使液體中不易降解的固體懸浮顆粒、菌體細(xì)胞以及膠體粒子等凝集、沉淀的特殊高分子代謝產(chǎn)物[2],主要包含糖蛋白、多糖、蛋白質(zhì)、纖維素和DNA等[3].它主要包括利用微生物細(xì)胞壁提取物的絮凝劑、利用微生物細(xì)胞代謝產(chǎn)物的絮凝劑和直接利用微生物細(xì)胞的絮凝劑.作為一種新興的絮凝劑,它具有安全、高效、可生物降解、不易造成二次污染等優(yōu)點(diǎn)[4],因此受到越來越多的關(guān)注和重視.目前,微生物絮凝劑的價(jià)格較高,主要是由于生產(chǎn)成本高和絮凝劑產(chǎn)率較低的原因.這是因?yàn)榕囵B(yǎng)基的組成及培養(yǎng)條件影響微生物絮凝劑產(chǎn)生菌的生理代謝,從而影響微生物絮凝劑的產(chǎn)率.筆者分析絮凝活性的分布以及對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化,旨在提高微生物絮凝劑的產(chǎn)率,為后期的深入研究和實(shí)現(xiàn)規(guī)?;a(chǎn)提供依據(jù).

    1 材料與方法

    1.1 材料

    芽孢桿菌(Bacill us sp.)EA,湖北工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院研究室分離保藏.

    種子培養(yǎng)基:葡萄糖,20 g/L;酵母膏,5 g/L;蛋白胨,10 g/L;氯化銨,2.5 g/L;磷酸二氫鉀,2 g/L;硫酸鎂,0.4 g/L;谷氨酸鈉,10 g/L.p H 7,115℃滅菌30 min.

    發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖,40 g/L;谷氨酸鈉,30 g/L;酵母膏,8 g/L;磷酸氫二鉀,0.5 g/L;Mn SO4·H2O,0.1 g/L;Fe Cl3·6 H2O,0.05 g/L;MgSO4·7 H2O,0.5 g/L;CaCl2·2 H2O,0.15 g/L.p H 7,115℃滅菌30 min.

    1.2 方法

    1.2.1 種子培養(yǎng)液的制備 取1環(huán)斜面菌種于裝有30 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,于28℃、180 r/min培養(yǎng)13 h得到種子培養(yǎng)液.

    1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng) 按5%接種量將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基(250 mL瓶裝50 mL)于37℃、200 r/min震蕩培養(yǎng)72h.

    1.2.3 絮凝率測(cè)定方法 以絮凝率表示絮凝活性,測(cè)定方法為:100 mL燒杯中加人0.2 g高嶺土,加50 mL蒸餾水、2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的Ca Cl2、1 mL發(fā)酵液,調(diào)p H至7.0.相同條件下不添加任何絮凝劑的水樣作為空白對(duì)照.采用磁力攪拌器,分兩段式攪拌:第一段為以120 r/min攪拌2 min;第二段為以80 r/min攪拌3 min,攪拌后靜止沉淀5 min.使用722型分光光度計(jì)在550 n m處測(cè)定上清液吸光度[5].絮凝率計(jì)算公式如下:

    絮凝率=(A-B)/A×100%.式中:A為對(duì)照上清液550n m處的吸光度;B

    為加樣上清液550n m處的吸光度.

    1.2.4 絮凝活性的分布 對(duì)同樣體積的未接種培養(yǎng)液、菌株發(fā)酵液(含菌體)、離心去菌體上清液和菌細(xì)胞懸液分別進(jìn)行絮凝活性測(cè)定.

    2 結(jié)果與分析

    2.1 絮凝活性的分布

    按5%接種量將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基(250 mL瓶裝50 mL)于37℃、200 r/min震蕩培養(yǎng)72h對(duì)菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng).對(duì)未接種的培養(yǎng)液、菌株發(fā)酵液(含菌體)、離心去菌體上清液和菌細(xì)胞懸液進(jìn)行絮凝活性測(cè)定,相對(duì)應(yīng)的高嶺土懸濁液絮凝率分別為0%、71.7%、74.4%、11.3%.

    未接種的培養(yǎng)液絮凝率為零,說明液體培養(yǎng)基中不含有絮凝成分物質(zhì).菌株發(fā)酵液和離心上清液的絮凝率都高達(dá)70%以上.含菌體發(fā)酵液比離心去菌體上清液絮凝率稍低,可能是菌體較輕,在發(fā)酵液中處于懸浮狀態(tài),阻礙了光的通過[6].可知EA菌產(chǎn)生的絮凝物質(zhì)主要存在于發(fā)酵液中,是由微生物在發(fā)酵過程中產(chǎn)生并分泌到胞外.

    2.2 培養(yǎng)基組成對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)物絮凝活性的影響

    2.2.1 不同碳源對(duì)產(chǎn)物絮凝特性的影響及最佳碳源含量的優(yōu)化 按照發(fā)酵培養(yǎng)基的材料,不加碳源,配置好250 mL的無碳源發(fā)酵培養(yǎng)基.在培養(yǎng)基的其他成分不變的情況下,更換不同的碳源(各碳源的質(zhì)量相同),在同樣的條件下考察菌株EA的發(fā)酵培養(yǎng)液的絮凝率,不同碳源的絮凝率分別為:甘油,61.3%;葡萄糖,73.2%;蔗糖,67.1%;淀粉,72.3%.可見采用葡萄糖和淀粉作為碳源時(shí),產(chǎn)物絮凝率較高.在進(jìn)行72 h發(fā)酵培養(yǎng)之后,以葡萄糖作為碳源的發(fā)酵液粘性最大,用此發(fā)酵液對(duì)高嶺土懸濁液進(jìn)行絮凝時(shí)形成的絮體比其他樣品都大,而且在慢攪過程中絮體就已經(jīng)沉降,原本渾濁的液體變得澄清.與此相比,其他幾種碳源雖也有較為明顯的絮凝作用,但形成的絮體較小,沉淀速度較慢.分別測(cè)量四種物質(zhì)作為菌株EA碳源發(fā)酵72 h后菌細(xì)胞懸液的OD值,發(fā)現(xiàn)以葡萄糖和淀粉為碳源的明顯較大,說明EA菌在含這兩種葡萄糖和淀粉的培養(yǎng)基中的數(shù)量,明顯多于其他兩種碳源的培養(yǎng)基.這兩種碳源,既有利于菌株EA的生長(zhǎng),又利于絮凝劑的產(chǎn)生.葡萄糖的結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單,可以被直接吸收利用,有利于細(xì)胞的代謝和產(chǎn)物的合成,故選取葡萄糖作為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源.

    2.2.2 不同氮源對(duì)產(chǎn)物絮凝特性的影響及最佳氮源含量的優(yōu)化 按照發(fā)酵培養(yǎng)基的材料,不加氮源,配置好250 mL的無氮源發(fā)酵培養(yǎng)基,在培養(yǎng)基其他成分不變的情況下更換不同的氮源(各氮源的質(zhì)量相同),考察發(fā)酵72 h后各個(gè)發(fā)酵液的絮凝率,其試驗(yàn)結(jié)果如下:酵母膏,72.4%;硫酸銨,44.2%;蛋白胨,68.6%;氯化銨,48.5%.可以看出,各氮源對(duì)菌株EA所產(chǎn)絮凝劑的影響較大,且酵母膏和蛋白胨等有機(jī)氮源的絮凝率明顯高于硫酸銨和氯化銨.以酵母膏作為氮源所得到的發(fā)酵液絮凝率最高,故選取酵母膏作為發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源.

    2.3 培養(yǎng)條件對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)物絮凝活性的影響

    2.3.1 p H值的影響 用Na OH溶液分別調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的初始p H 值,分別為至5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0.測(cè)出不同p H值所對(duì)應(yīng)的菌株發(fā)酵產(chǎn)物的絮凝率依次為33.2%、52.3%、69.5%、72.9%、75.2%和71.1%.可見菌株EA的最適初始p H值為7.5.培養(yǎng)基初始p H值過高或過低都不利于絮凝劑的產(chǎn)生,這是因?yàn)镠+和OH-能夠影響酶蛋白的氨基解離度和電荷情況,改變酶的結(jié)構(gòu)和功能,引起酶活性的改變.而菌的代謝和絮凝劑的產(chǎn)生都是在酶的作用下發(fā)生的生化反應(yīng),p H值控制H+和OH-濃度,從而影響菌的代謝和絮凝劑的產(chǎn)生[7].

    2.3.2 溫度的影響 調(diào)節(jié)恒溫震蕩培養(yǎng)箱的溫度,分別設(shè)定為28℃、32℃、37℃、40℃.在菌株發(fā)酵培養(yǎng)72 h后其產(chǎn)物絮凝率分別為49.3%、69.1%、74.6%和73.5%,說明菌株EA在37℃時(shí)產(chǎn)物的絮凝效果最好.溫度過低,細(xì)胞本身的聲場(chǎng)受到抑制,酶促反應(yīng)速度緩慢,影響產(chǎn)物的生成.當(dāng)溫度偏高時(shí),絮凝率下降,因?yàn)樾跄齽┍旧沓煞质翘堑鞍?、多糖、蛋白質(zhì)、DNA等,高溫可能導(dǎo)致變性,處理效果受到影響[8].

    2.3.3 不同接種量的影響 在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別以1%、2%、3%、4%、5%的接種量接入種子液,經(jīng)搖床培養(yǎng)72 h后,分別測(cè)定各組發(fā)酵液的絮凝活性,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示.

    圖1 接種量對(duì)絮凝率的影響

    接種量為3%時(shí),絮凝率較高,為75.4%;之后,隨著接種量的增大,絮凝率降低.由于接種量過大,培養(yǎng)液中細(xì)菌的初始濃度高,生長(zhǎng)初期細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖則會(huì)消耗大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì);而接種量過小,培養(yǎng)液中細(xì)菌濃度低,使得培養(yǎng)周期延長(zhǎng).

    2.3.4 正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上采用正交實(shí)驗(yàn)方法對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化.實(shí)驗(yàn)采用L9(34)方法設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn),相對(duì)應(yīng)的三個(gè)因素取為接種量、初始p H值和培養(yǎng)溫度,每個(gè)因素考察3個(gè)水平.正交實(shí)驗(yàn)的因素水平見表1.

    表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

    表2 正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    圖2 K與各因子之間的關(guān)系

    表2中 K1、K2、K3分別表示第1、2、3列中水平對(duì)應(yīng)的試驗(yàn)結(jié)果之和.為了比較各因素對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物絮凝活性的影響大小,選出各因素中對(duì)指標(biāo)最有利的水平,以各因素的不同水平為橫坐標(biāo),以各因素對(duì)應(yīng)的K的平均值為縱坐標(biāo),作因素和指標(biāo)關(guān)系圖.從圖2中可以看出因素B(培養(yǎng)基初始p H值)的三個(gè)點(diǎn)高低相差較大,即極差R最大,因此對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物絮凝活性的影響最顯著.其次是因素C,影響最小的是因素A,表中最佳培養(yǎng)條件是B3C2A2,即初始p H為7.5,培養(yǎng)溫度為37℃,種子液接種量為4%.選取B2C2A1為培養(yǎng)條件,即選擇單因子實(shí)驗(yàn)時(shí)各因素中最優(yōu)條件進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),測(cè)其絮凝率為76.6%,小于78.5%.故最佳培養(yǎng)條件為B3C2A2.

    3 結(jié)論與展望

    通過對(duì)未接種的培養(yǎng)液、菌株發(fā)酵液(含菌體)、離心去菌體上清液和菌細(xì)胞懸液進(jìn)行絮凝活性測(cè)定,得出發(fā)揮絮凝作用的物質(zhì)是EA菌的發(fā)酵產(chǎn)物,是由微生物在發(fā)酵過程中產(chǎn)生并分泌到胞外.通過單因子實(shí)驗(yàn)得到最佳碳源是葡萄糖,在以葡萄糖作為碳源時(shí),EA菌的生長(zhǎng)旺盛,絮凝率最高.在發(fā)酵培養(yǎng)基中有機(jī)氮源的效果較好,以酵母膏作為氮源時(shí),絮凝效果最好.通過培養(yǎng)條件單因子實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)得到的最佳培養(yǎng)條件為:菌株EA發(fā)酵培養(yǎng)的最適初始p H7.5,最適培養(yǎng)溫度為37℃,最適宜接種量為4%.菌株發(fā)酵液的絮凝率也從初始的71.7%提高到78.5%.

    在實(shí)驗(yàn)室研究階段培養(yǎng)成本很高,而尋找廉價(jià)的秸稈、纖維素等有機(jī)物質(zhì)含量豐富的廢水等作為培養(yǎng)底物是推動(dòng)微生物絮凝劑工業(yè)化進(jìn)程的重要途徑.其次,利用分子生物學(xué)技術(shù)加強(qiáng)絮凝劑產(chǎn)生菌的絮凝基因研究,把控制絮凝劑生成的基因?qū)氲教囟ǖ奈⑸锛?xì)胞內(nèi)表達(dá),可以省去篩選的過程并很可能大大提高絮凝劑產(chǎn)率.再次,利用菌株間的相互作用,將絮凝菌同其他污水處理的菌株進(jìn)行復(fù)配,可以拓寬絮凝劑的使用范圍,對(duì)多種污水進(jìn)行處理處置.最后,生物化學(xué)聯(lián)合絮凝劑能很大程度上提高絮凝劑的使用效率和處理效果,也將是今后微生物絮凝劑領(lǐng)域一個(gè)新的研究方向.

    [1]Ning He,Yin Li,Jian Chen,Shi-yi Lun.Identification of a novel bioflocculant from a newly isolated Cor ynebacteriu mglutamicu m [J].Biochemical Engineering Jour nal,2002,11:127-148.

    [2]陳元彩,肖 錦.天然有機(jī)高分子絮凝劑研究與應(yīng)用[J].工業(yè)水處理,1999,19(4):11-13.

    [3]Takeda M,Kurane R,Koizu mi J.Agric Bio chem,[J].1991,55(10):2 663-2 664.

    [4]劉自蓮,施永生,李 鵬,等.微生物絮凝劑及其應(yīng)用[J].工業(yè)用水與廢水,2008,39(2):17-20.

    [5]呂亞芳,趙 敏,汪春蕾,等.微生物絮凝劑產(chǎn)生菌的篩選與絮凝條件[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2008,36(2):63-64.

    [6]張 慧.微生物絮凝劑產(chǎn)生菌培養(yǎng)條件優(yōu)化及替代培養(yǎng)基研究[D].重慶:重慶工商大學(xué)環(huán)境與生物工程學(xué)院,2008.

    [7]劉 松,張?zhí)m英.微生物絮凝劑誘變菌最佳培養(yǎng)條件及化學(xué)成分[J].環(huán)境科學(xué)與技術(shù),2006,29(1):18-20.

    [8]趙東風(fēng),劉 潔,張?jiān)撇ǎ?復(fù)合型微生物絮凝劑的絮凝條件優(yōu)化[J].中工業(yè)水處理,2010,30(4):66-68.

    猜你喜歡
    絮凝劑氮源發(fā)酵液
    連翹內(nèi)生真菌的分離鑒定及其發(fā)酵液抑菌活性和HPLC測(cè)定
    一種油井水泥用抗分散絮凝劑
    桑黃纖孔菌發(fā)酵液化學(xué)成分的研究
    中成藥(2018年1期)2018-02-02 07:20:03
    絮凝劑在造紙行業(yè)中的應(yīng)用及進(jìn)展
    聚硅酸/聚丙烯酰胺復(fù)合絮凝劑的研究
    無機(jī)氮源對(duì)紅曲霉調(diào)控初探
    Fe3 O4=PAC磁絮凝劑的制備及其絮凝性能研究
    中藥渣生產(chǎn)蛋白飼料的氮源優(yōu)化研究
    響應(yīng)面分析法和氮源改進(jìn)優(yōu)化L-賴氨酸發(fā)酵工藝
    HPLC與LC-MS/MS測(cè)定蛹蟲草發(fā)酵液中蟲草素的方法比較
    国产av不卡久久| 国产久久久一区二区三区| 可以在线观看毛片的网站| 久久久久国产网址| 日本五十路高清| 草草在线视频免费看| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 亚洲欧美清纯卡通| 天堂影院成人在线观看| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 男人舔女人下体高潮全视频| 午夜亚洲福利在线播放| 一级黄片播放器| 免费黄网站久久成人精品| 一级毛片aaaaaa免费看小| 国产黄片美女视频| 亚洲精品成人久久久久久| 少妇的逼好多水| 性插视频无遮挡在线免费观看| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 成人精品一区二区免费| 在线a可以看的网站| 亚洲国产高清在线一区二区三| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| av在线亚洲专区| 亚洲av美国av| 婷婷精品国产亚洲av| 欧美另类亚洲清纯唯美| 高清毛片免费观看视频网站| 成人精品一区二区免费| 色视频www国产| 国产美女午夜福利| 毛片女人毛片| 国产精品一区www在线观看| 少妇人妻精品综合一区二区 | 久久综合国产亚洲精品| 国产一区二区在线av高清观看| www.色视频.com| 亚洲无线观看免费| 亚洲人成网站在线播| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 日韩大尺度精品在线看网址| 丝袜喷水一区| 日韩欧美国产在线观看| 青春草视频在线免费观看| 久久久精品大字幕| 波多野结衣巨乳人妻| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 久久鲁丝午夜福利片| 欧美三级亚洲精品| 欧美又色又爽又黄视频| 男人舔女人下体高潮全视频| 天堂动漫精品| 观看美女的网站| 最近手机中文字幕大全| 成人一区二区视频在线观看| 中文字幕av成人在线电影| 变态另类丝袜制服| 国产日本99.免费观看| 成人综合一区亚洲| 亚洲av不卡在线观看| 国产爱豆传媒在线观看| 欧美+日韩+精品| 韩国av在线不卡| 一本一本综合久久| 岛国在线免费视频观看| 精品免费久久久久久久清纯| av在线播放精品| 久99久视频精品免费| 免费看日本二区| 天堂网av新在线| 老司机午夜福利在线观看视频| 特大巨黑吊av在线直播| 如何舔出高潮| 国产日本99.免费观看| 少妇人妻精品综合一区二区 | 深爱激情五月婷婷| 美女内射精品一级片tv| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 干丝袜人妻中文字幕| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 真实男女啪啪啪动态图| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 观看免费一级毛片| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 免费搜索国产男女视频| 少妇丰满av| 人人妻人人澡欧美一区二区| 99久久九九国产精品国产免费| 国产伦在线观看视频一区| 国产色爽女视频免费观看| 中国美女看黄片| 97热精品久久久久久| 中国美女看黄片| 99久久精品国产国产毛片| 一进一出抽搐动态| 色播亚洲综合网| 校园人妻丝袜中文字幕| 午夜亚洲福利在线播放| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 一夜夜www| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 可以在线观看的亚洲视频| 春色校园在线视频观看| 久久99热这里只有精品18| 两个人的视频大全免费| 免费一级毛片在线播放高清视频| 淫妇啪啪啪对白视频| 国产av麻豆久久久久久久| 欧美潮喷喷水| 中文在线观看免费www的网站| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 毛片女人毛片| 99久久精品国产国产毛片| 插阴视频在线观看视频| 韩国av在线不卡| 啦啦啦啦在线视频资源| 午夜精品一区二区三区免费看| 久久久久国产网址| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 精品日产1卡2卡| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 一区二区三区四区激情视频 | 亚洲av成人av| 观看免费一级毛片| 日韩欧美国产在线观看| 亚洲四区av| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 久久午夜亚洲精品久久| 欧美色视频一区免费| 一进一出抽搐动态| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 给我免费播放毛片高清在线观看| a级毛片免费高清观看在线播放| 六月丁香七月| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 在线观看美女被高潮喷水网站| 亚洲乱码一区二区免费版| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| av在线天堂中文字幕| 欧美成人一区二区免费高清观看| 亚洲性夜色夜夜综合| 日韩亚洲欧美综合| 久久九九热精品免费| 校园春色视频在线观看| 色5月婷婷丁香| 美女免费视频网站| 国产一区亚洲一区在线观看| 精品一区二区三区视频在线| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 国产视频一区二区在线看| 美女大奶头视频| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 国产乱人偷精品视频| 精品一区二区三区av网在线观看| 色在线成人网| 毛片女人毛片| 午夜视频国产福利| 在线观看一区二区三区| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 91久久精品国产一区二区三区| 久久人人爽人人片av| 久久人妻av系列| 午夜福利高清视频| 亚洲精品色激情综合| 三级毛片av免费| 亚洲av成人精品一区久久| 嫩草影视91久久| 日韩欧美三级三区| 亚洲精品久久国产高清桃花| 别揉我奶头 嗯啊视频| 日韩国内少妇激情av| 色噜噜av男人的天堂激情| 亚洲最大成人av| 国产成人影院久久av| 国产在视频线在精品| 在现免费观看毛片| 嫩草影院精品99| 嫩草影视91久久| 亚洲电影在线观看av| 久久精品夜色国产| 能在线免费观看的黄片| 久久草成人影院| 精品午夜福利视频在线观看一区| 热99re8久久精品国产| 在现免费观看毛片| 人妻少妇偷人精品九色| 国产成人影院久久av| 欧美xxxx性猛交bbbb| 一进一出抽搐动态| 在线看三级毛片| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 久久精品国产亚洲网站| 精品久久久噜噜| 身体一侧抽搐| 国产亚洲91精品色在线| 在线免费十八禁| 欧美xxxx性猛交bbbb| 国产成人freesex在线 | 免费av不卡在线播放| 国产亚洲91精品色在线| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 日本黄色片子视频| 成人精品一区二区免费| 久久热精品热| 免费人成视频x8x8入口观看| 久久人人爽人人片av| 亚洲专区国产一区二区| 丰满人妻一区二区三区视频av| 欧美性猛交黑人性爽| 亚洲人与动物交配视频| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 日韩一本色道免费dvd| 成人三级黄色视频| 日韩av在线大香蕉| 一本精品99久久精品77| 亚洲成人av在线免费| 国产精品三级大全| 欧美3d第一页| 少妇的逼水好多| 男人舔女人下体高潮全视频| 丝袜美腿在线中文| 欧美高清成人免费视频www| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 亚洲五月天丁香| 色av中文字幕| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 亚洲精品国产成人久久av| 俄罗斯特黄特色一大片| 欧美成人精品欧美一级黄| 国产免费一级a男人的天堂| 国产成人91sexporn| 日本欧美国产在线视频| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 1000部很黄的大片| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 日日摸夜夜添夜夜爱| 精品午夜福利视频在线观看一区| 尾随美女入室| 长腿黑丝高跟| 高清毛片免费观看视频网站| 免费看光身美女| 婷婷色综合大香蕉| 亚洲人与动物交配视频| 欧美不卡视频在线免费观看| 22中文网久久字幕| 1024手机看黄色片| av专区在线播放| h日本视频在线播放| 亚洲一区二区三区色噜噜| 波多野结衣高清作品| 国产成人aa在线观看| 精品国内亚洲2022精品成人| 无遮挡黄片免费观看| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 免费观看精品视频网站| 亚洲国产精品sss在线观看| 日韩av在线大香蕉| 91狼人影院| 村上凉子中文字幕在线| 麻豆乱淫一区二区| 欧美日本视频| 黄片wwwwww| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 精品久久久噜噜| 网址你懂的国产日韩在线| 久久欧美精品欧美久久欧美| 六月丁香七月| 99热精品在线国产| 黑人高潮一二区| 一个人免费在线观看电影| 国产高清三级在线| 国产高潮美女av| 99riav亚洲国产免费| 淫妇啪啪啪对白视频| 国产精品av视频在线免费观看| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 成人国产麻豆网| 国产美女午夜福利| 国产黄片美女视频| 最近中文字幕高清免费大全6| 国产中年淑女户外野战色| 99精品在免费线老司机午夜| 欧美精品国产亚洲| a级毛色黄片| 身体一侧抽搐| av卡一久久| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 久久久久久九九精品二区国产| 国产精品久久久久久av不卡| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 男女下面进入的视频免费午夜| 久久九九热精品免费| 免费av不卡在线播放| 99久久中文字幕三级久久日本| 如何舔出高潮| .国产精品久久| 91在线精品国自产拍蜜月| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 久久热精品热| 激情 狠狠 欧美| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 成人综合一区亚洲| 91在线观看av| 亚洲av五月六月丁香网| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| av黄色大香蕉| 麻豆一二三区av精品| 色综合色国产| 99国产极品粉嫩在线观看| 国产不卡一卡二| a级毛片a级免费在线| 人妻少妇偷人精品九色| 亚洲第一电影网av| 欧美一区二区精品小视频在线| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 国产欧美日韩一区二区精品| 成人欧美大片| 全区人妻精品视频| 精品人妻偷拍中文字幕| 日本 av在线| 黄色视频,在线免费观看| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 91狼人影院| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 99九九线精品视频在线观看视频| 亚洲av免费高清在线观看| 久久久久久久久久久丰满| 天天躁日日操中文字幕| 成人午夜高清在线视频| 综合色av麻豆| 在线观看一区二区三区| 深爱激情五月婷婷| 久久久久国内视频| 国产成人91sexporn| h日本视频在线播放| 啦啦啦韩国在线观看视频| 最新在线观看一区二区三区| 久99久视频精品免费| 一级黄色大片毛片| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 熟女电影av网| 欧美日本亚洲视频在线播放| 亚洲av.av天堂| 99热只有精品国产| 国产黄色小视频在线观看| 人妻久久中文字幕网| 亚洲在线观看片| 国产精品综合久久久久久久免费| 高清日韩中文字幕在线| 国产伦精品一区二区三区视频9| 一级毛片电影观看 | 在线免费观看不下载黄p国产| 亚洲中文日韩欧美视频| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 日日干狠狠操夜夜爽| 一进一出抽搐动态| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 免费人成在线观看视频色| 高清午夜精品一区二区三区 | 免费观看精品视频网站| 精品午夜福利视频在线观看一区| 麻豆乱淫一区二区| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 亚洲最大成人中文| 亚洲自拍偷在线| 综合色av麻豆| 中出人妻视频一区二区| 欧美高清性xxxxhd video| 观看免费一级毛片| 亚洲第一电影网av| 1024手机看黄色片| 成人一区二区视频在线观看| 国产伦精品一区二区三区四那| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 欧美一区二区亚洲| 最近2019中文字幕mv第一页| 免费人成在线观看视频色| 国产成人精品久久久久久| 国产毛片a区久久久久| 成人亚洲欧美一区二区av| 亚洲欧美日韩无卡精品| a级毛片a级免费在线| 日韩亚洲欧美综合| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 永久网站在线| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 国产成人福利小说| АⅤ资源中文在线天堂| 国产一区二区在线av高清观看| 亚洲最大成人手机在线| 亚洲av电影不卡..在线观看| 国产伦一二天堂av在线观看| 午夜福利在线在线| 一级毛片电影观看 | 校园春色视频在线观看| 在线观看av片永久免费下载| 国产成人福利小说| 亚洲欧美日韩高清专用| 久久鲁丝午夜福利片| 欧美日韩精品成人综合77777| 日韩成人av中文字幕在线观看 | 精品一区二区三区av网在线观看| 深夜a级毛片| 国产精品久久久久久av不卡| 日韩精品中文字幕看吧| 亚洲性夜色夜夜综合| 亚洲,欧美,日韩| 久久人人爽人人爽人人片va| 欧美高清成人免费视频www| 男人舔女人下体高潮全视频| 国产综合懂色| 熟女电影av网| 熟女人妻精品中文字幕| 久久鲁丝午夜福利片| 欧美成人a在线观看| 久久久久久久亚洲中文字幕| 久久精品国产清高在天天线| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 永久网站在线| 免费观看的影片在线观看| 日本黄大片高清| 精品久久久久久久久av| 国产av麻豆久久久久久久| 久久久久久大精品| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 亚洲国产欧美人成| 亚洲在线自拍视频| 天堂动漫精品| 久久精品国产亚洲网站| 男人舔女人下体高潮全视频| 级片在线观看| 亚洲美女视频黄频| 亚洲三级黄色毛片| 国产精品一区二区性色av| 国模一区二区三区四区视频| 99热这里只有是精品50| 亚洲最大成人av| 亚洲人与动物交配视频| 村上凉子中文字幕在线| 国产爱豆传媒在线观看| 又爽又黄无遮挡网站| 最好的美女福利视频网| aaaaa片日本免费| 无遮挡黄片免费观看| 亚洲久久久久久中文字幕| 久久久午夜欧美精品| 99久国产av精品| 日韩av不卡免费在线播放| 免费看av在线观看网站| 亚洲av五月六月丁香网| 在现免费观看毛片| 国产三级在线视频| 国产片特级美女逼逼视频| 又粗又爽又猛毛片免费看| 精品无人区乱码1区二区| 精品人妻偷拍中文字幕| 精品午夜福利视频在线观看一区| 欧美三级亚洲精品| 在线看三级毛片| 国产黄片美女视频| 麻豆成人午夜福利视频| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 国产精品一二三区在线看| 在线天堂最新版资源| 长腿黑丝高跟| 内射极品少妇av片p| 亚洲欧美日韩高清专用| 国产精品电影一区二区三区| 免费大片18禁| 联通29元200g的流量卡| 天堂动漫精品| 国产美女午夜福利| www日本黄色视频网| 日韩高清综合在线| .国产精品久久| 在线免费十八禁| 白带黄色成豆腐渣| 插阴视频在线观看视频| 观看免费一级毛片| 黄色视频,在线免费观看| 天堂√8在线中文| 国产精品电影一区二区三区| 在线观看一区二区三区| 精品久久久噜噜| 一区福利在线观看| 亚洲精品456在线播放app| 婷婷六月久久综合丁香| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 国产亚洲91精品色在线| 中国美白少妇内射xxxbb| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 日韩av在线大香蕉| 身体一侧抽搐| 欧美在线一区亚洲| 国产高清视频在线播放一区| 成熟少妇高潮喷水视频| 午夜影院日韩av| 男人狂女人下面高潮的视频| 日韩人妻高清精品专区| 久99久视频精品免费| 婷婷色综合大香蕉| 欧美一级a爱片免费观看看| 国产精品一区二区三区四区久久| 欧美日韩国产亚洲二区| 国产黄a三级三级三级人| 国产免费男女视频| 亚洲精品国产av成人精品 | 99久久精品国产国产毛片| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 在线a可以看的网站| 六月丁香七月| 日韩精品青青久久久久久| 最近在线观看免费完整版| 99国产极品粉嫩在线观看| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 99久久精品热视频| 日韩欧美在线乱码| 亚洲美女视频黄频| 少妇的逼水好多| 免费人成视频x8x8入口观看| 欧美区成人在线视频| 国产日本99.免费观看| 神马国产精品三级电影在线观看| 99久久成人亚洲精品观看| 国产一区二区在线av高清观看| 久久久久久久久中文| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 人妻少妇偷人精品九色| 亚洲欧美精品自产自拍| 99热6这里只有精品| 日本 av在线| 高清毛片免费看| 丰满乱子伦码专区| 日韩大尺度精品在线看网址| 99国产精品一区二区蜜桃av| 精品不卡国产一区二区三区| 亚洲va在线va天堂va国产| 日本与韩国留学比较| 三级毛片av免费| 少妇丰满av| 麻豆一二三区av精品| 变态另类丝袜制服| 免费无遮挡裸体视频| 久久精品夜色国产| 国产精品福利在线免费观看| 精品一区二区三区av网在线观看| 2021天堂中文幕一二区在线观| 国产精品伦人一区二区| 99在线人妻在线中文字幕| 亚洲丝袜综合中文字幕| 亚洲高清免费不卡视频| 亚洲av中文av极速乱| 美女高潮的动态| 波多野结衣高清作品| 成人欧美大片| videossex国产| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 久久6这里有精品| 国产一级毛片七仙女欲春2| 久久午夜亚洲精品久久| 亚洲乱码一区二区免费版| 精品午夜福利视频在线观看一区| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 成人一区二区视频在线观看| 嫩草影院新地址| 精品福利观看| 亚洲成a人片在线一区二区| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 国产成人a区在线观看| 黄色视频,在线免费观看| 欧美人与善性xxx| 男人和女人高潮做爰伦理| 成年女人看的毛片在线观看| 人妻久久中文字幕网| 九九热线精品视视频播放| 麻豆一二三区av精品| 高清毛片免费观看视频网站| 精品不卡国产一区二区三区| 毛片女人毛片| 午夜a级毛片| 国产色爽女视频免费观看| 亚洲av熟女| 国产毛片a区久久久久| 免费观看的影片在线观看| 看非洲黑人一级黄片| 午夜福利成人在线免费观看| 国产精品日韩av在线免费观看| 欧美最新免费一区二区三区| 久久久国产成人免费| 少妇被粗大猛烈的视频| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 国产一区二区激情短视频| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 一区二区三区四区激情视频 | 蜜臀久久99精品久久宅男| 一本精品99久久精品77| 国产高清激情床上av| 欧美日韩国产亚洲二区| 简卡轻食公司| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 六月丁香七月| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 99热这里只有是精品50|