支持向量機和鄰接法在夜蛾科昆蟲條碼研究中的應(yīng)用

李 俊，韓輝林，高 強，金 倩，遲美妍，武春生，張愛兵*首都師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京00048;東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱50040;中國科學(xué)院動物研究所，北京000

夜蛾科隸屬鱗翅目，為該目第一大科，目前已知種類超過3.5萬種(Poole，1989)。由于夜蛾科昆蟲具有危害方式多樣、發(fā)生時期不同、近緣種類繁多、個體變異豐富等特點，且從事傳統(tǒng)分類的學(xué)者日趨減少等，導(dǎo)致除粘蟲類、地老虎類、煙青蟲Helicoverpa assulta(Guenée)、棉鈴蟲 Helicoverpa armig-era(Hübner)等重要的農(nóng)林害蟲外，其他大部分種類的相關(guān)研究極其薄弱(陳一心，1999)。近年來，隨著形態(tài)分類學(xué)多元信息的整合以及分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，傳統(tǒng)夜蛾科分類系統(tǒng)發(fā)生了很大變化(Zahiri et al.，2010、2012)。但是，由于新系統(tǒng)還存在一定的不穩(wěn)定性，本文以傳統(tǒng)的分類系統(tǒng)為主予以研究。

DNA 條形碼被 Hebert et al.(2003a、b)和 Remigio＆Hebert(2003)提出之后，得到了國際上的廣泛關(guān)注。許多研究者將DNA條形碼應(yīng)用于物種鑒定中，其利用一段基因序列作為分子標(biāo)記來快速、準(zhǔn)確、自動化地對物種進(jìn)行鑒定(Hajibabaei et al.，2006)。目前，DNA條形碼數(shù)據(jù)分析倡議協(xié)會(DNA Barcode Data Analysis Initiative，DBDAI)把線粒體COⅠ基因5'端起始的長度為658 bp的一段序列作為動物物種鑒定的標(biāo)準(zhǔn)序列(Ratnasinghan＆Hebert，2007)。這段COⅠ序列在后生多細(xì)胞動物群，包括脊椎動物(Francis et al.，2010;Hubert et al.，2008;Tavares ＆ Baker，2008)和無脊椎動物(Jennings et al.，2010;Johnson et al.，2008;Zhou et al.，2009)的物種鑒定和隱存種鑒定方面都很有效(Efe et al.，2009;Johnson et al.，2008;Kerr et al.，2009)。但是，DNA條形碼技術(shù)在物種鑒定方面仍然存在爭議(Will＆Rubinoff，2004)，一些以形態(tài)鑒定為主的學(xué)者認(rèn)為，物種鑒定需要依靠經(jīng)驗(Elias et al.，2007;Hurst＆ Jiggins，2005;Meyer＆ Paulay，2005;Wiemers ＆ Fiedler，2007)和理論知識(Hickerson et al.，2006)的積累。

支持向量機(support vector machine)又稱支持向量網(wǎng)絡(luò)(Cortes＆ Vapnik，2009)，于1995年被提出，是在統(tǒng)計學(xué)理論基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的機器學(xué)習(xí)方法，在機器學(xué)習(xí)的許多方面表現(xiàn)出特有的優(yōu)勢，如解決小樣本、非線性和高維模式識別等問題，并且在函數(shù)擬合等機器學(xué)習(xí)中得到推廣和應(yīng)用(郎宇寧和藺娟如，2010)。由于支持向量機具有理論完備、適應(yīng)性強、全局優(yōu)化、訓(xùn)練時間短、泛化性能好等優(yōu)點，已經(jīng)成為目前國內(nèi)外研究的熱點(邊肇祺和張學(xué)工，2000)。目前，支持向量機在數(shù)據(jù)分類(杜燦誼等，2012;李晟和何明一，2012;秦傳東等，2012)、回歸估計、函數(shù)逼近等領(lǐng)域展開了應(yīng)用并取得良好的效果(Brown et al.，2000;Mukherjee，2003;Walavalkar，2003;Zhao ＆ Principe，2001)。然而，支持向量機應(yīng)用于DNA條形碼方法的例子還較少。因此，本研究以北京妙峰山采集的101只夜蛾科昆蟲的COⅠ序列和網(wǎng)站下載的14條夜蛾COⅠ序列作為研究材料，通過傳統(tǒng)的形態(tài)鑒定方法和DNA條形碼分類方法鑒定物種，利用支持向量機和鄰接法(Mailund et al.，2006)對鑒定結(jié)果進(jìn)行研究，以進(jìn)一步驗證COⅠ基因?qū)[翅目夜蛾科的鑒定效果。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

在北京妙峰山地區(qū)的鷲峰(E116°06.081'、N40°06.907')、隴駕莊(E116°03.347'、N39°58.321')、澗溝(E116°01'55.1″、N40°03'44.7″)，利用高壓汞燈誘集夜蛾科昆蟲，分別采樣21、20、60頭，然后冷凍致死。

1.2 樣品的保存與鑒定

樣本采集后展翅保存，制作外生殖器玻片，以進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。經(jīng)形態(tài)專家鑒定，101個樣本來自58種夜蛾(表1)。

1.3 COⅠ序列的擴(kuò)增及分析

DNA模板選自樣本腿部肌肉組織，通過Biomed組織/細(xì)胞基因組DNA快速提取試劑盒提取。COⅠ序列通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增，反應(yīng)體系 30 μL:模板 DNA 3 μL，引物 COⅠ F 0.6 μL，引物 COⅠ R 0.6 μL，耐熱聚合酶鏈反應(yīng)化合物 15 μL，雙蒸水 10.8 μL。采用的引物:上游引物 F1 ATTCAACCAATCATAAAGATAT，下游引物 R1 TAAACTTCTGGATGTCCAAAAA。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性2 min;40個循環(huán)包括94℃變性20 s，52℃退火20 s，72 ℃復(fù)性45 s，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取3 μL反應(yīng)體系進(jìn)行1%瓊脂糖電泳檢測，若有條帶在650 bp左右，則送中科希林生物有限公司北京分公司測序。

將提取的COⅠ序列組合分成3套數(shù)據(jù)集。所有夜蛾樣本組成的數(shù)據(jù)集為數(shù)據(jù)集Ⅰ，剔除所有單序列的夜蛾種類組成的數(shù)據(jù)集為數(shù)據(jù)集Ⅱ，在數(shù)據(jù)集Ⅱ的基礎(chǔ)上增加網(wǎng)站上下載的14條夜蛾科數(shù)據(jù)構(gòu)成的數(shù)據(jù)集為數(shù)據(jù)集Ⅲ。將這些COⅠ序列集分別通過 Chromas進(jìn)行編輯和修改，再用 Mega 4.0(Tamura et al.，2007)對序列進(jìn)行比對，轉(zhuǎn)化為Mega 4.0(Tamura et al.，2007)可讀文件。在此基礎(chǔ)上，使用 Mega 4.0(Tamura et al.，2007)和 K2P(Kimura，1980)模型中的計算和建樹功能，對3套數(shù)據(jù)進(jìn)行遺傳距離分析并構(gòu)建NJ樹(Saitou＆Nei，1987)。

表1 樣本及其COⅠ序列的GenBank登錄序列號Table 1 Noctuidea samples and GenBank accession numbers of their COⅠgene sequences

對所構(gòu)建的NJ樹進(jìn)行成功率的評價。在序列Q經(jīng)形態(tài)鑒定為物種A的情況下，序列Q跟物種A聚在一起，而A沒有其他的分支，認(rèn)為NJ樹聚類成功;Q在物種A和B之外，認(rèn)為Q屬于其他物種，NJ樹聚類失敗;物種A形成2個分支，而序列Q聚集在占物種A個體數(shù)大于或等于50%的分支上，認(rèn)為Q屬于A物種，NJ樹聚類成功;如果測試序列Q聚集在物種A個體數(shù)不到50%的分支上，則認(rèn)為其不屬于A物種，NJ樹聚類失敗。這樣計算1000次的成功率:

Nsample=Nseq×1000;Rsuccess=Nsuccess/Nsample

支持向量機對3套數(shù)據(jù)進(jìn)行分類，采用libsvm軟件對所得到的妙峰山夜蛾科昆蟲的COⅠ序列數(shù)據(jù)集進(jìn)行研究，將其轉(zhuǎn)化為libsvm可讀文件(A=0.1，T=0.2，C=0.3，G=0.4)。在支持向量機類型為C-SVC和核函數(shù)類型為徑向基函數(shù)的基礎(chǔ)上，得到夜蛾科COⅠ序列的成功率。為了得到支持向量機的準(zhǔn)確率(accuracy)、敏感性(sensitivity)、特異性(specificity)和精密度(precision)4個參數(shù)，在原有的3套數(shù)據(jù)集上加入了22條舟蛾序列作為負(fù)樣本，分別命名為數(shù)據(jù)集Ⅰ'、數(shù)據(jù)集Ⅱ'和數(shù)據(jù)Ⅲ'。以數(shù)據(jù)集Ⅱ'為例，數(shù)據(jù)集Ⅱ'有55條序列，加入22條舟蛾科的COⅠ序列，總共77條COⅠ序列，隨機抽取數(shù)據(jù)集Ⅱ'80%的序列(62條序列)作為訓(xùn)練，數(shù)據(jù)集Ⅱ'20%的序列(15條序列)作為測試，通過以下公式(Perruchet＆ Peereman，2004;Velez et al.，2007;Walker et al.，1990)計算支持向量機的 4個參數(shù)。重復(fù)隨機抽取1000次，得到它們的平均值進(jìn)而驗證支持向量機的測試效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于NJ方法和支持向量機的夜蛾科鑒定

采用NJ方法的鑒定中，由于數(shù)據(jù)集Ⅰ存在許多單序列樣本(有些夜蛾種類僅有1個樣本)，在對NJ方法成功率的評估上效果不是很理想(55.5%)。因此，在數(shù)據(jù)集Ⅱ中剔除單序列樣本后進(jìn)行驗證，成功率達(dá)到89.1%(95%的置信區(qū)間CI:82.4% ～ 95.8%)(Clopper ＆ Pearson，1934)。在對數(shù)據(jù)集Ⅲ的評估中，成功率達(dá)到91.3%(95%的置信區(qū)間 CI:86.3% ～96.3%)(Clopper＆ Pearson，1934)。

通過支持向量機的方法對3套數(shù)據(jù)集(未加入舟蛾數(shù)據(jù)集)進(jìn)行鑒定，得到數(shù)據(jù)集Ⅰ、數(shù)據(jù)集Ⅱ、數(shù)據(jù)集Ⅲ的成功率分別為41.3%(95%的置信區(qū)間CI:40.7% ～42.0%)、83.8%(95% 的置信區(qū)間 CI:83.1% ～ 84.5%)、83.5%(95% 的置信區(qū)間 CI:82.9% ～84.1%)(Clopper ＆ Pearson，1934)。

舟蛾數(shù)據(jù)集對支持向量機的成功率影響較小(表2)。從圖1也可以看出，增加物種數(shù)量和同種個體數(shù)，NJ方法的驗證效果會提高，而對支持向量機的影響較小?？傮w來說，NJ方法的效果優(yōu)于支持向量機，主要由于它們的驗證方法不同，支持向量機需要把數(shù)據(jù)集分為2份，一套進(jìn)行訓(xùn)練，一套進(jìn)行測試，很可能將2個同種數(shù)據(jù)作為預(yù)測的數(shù)據(jù)集，從而降低了成功率。如果樣本容量足夠大，同種個體數(shù)足夠多，支持向量機的成功率可能會提高。

表2 通過3套數(shù)據(jù)集計算出的支持向量機的4個參數(shù)Table 2 Four parameters of SVM calculated by three databases

2.2 系統(tǒng)發(fā)育樹分析

基于數(shù)據(jù)集ⅡCOⅠ序列構(gòu)建的NJ樹如圖2所示。NJ樹可以正確地按照親緣關(guān)系將55個樣本聚類，節(jié)點中的數(shù)值為各自的Bootstrap值。從圖中可以發(fā)現(xiàn)，除棉鈴蟲和煙青蟲、大三角魯夜蛾Xestia kollari(Laderer)和兀魯夜蛾 X.ditrapezium(Denis et Schiffermuller)外，其他樣本在NJ樹上大體都有清晰的劃分。從傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)上看，棉鈴蟲與煙青蟲的親緣關(guān)系比較近，生活的環(huán)境相似，它們之間出現(xiàn)了雜交現(xiàn)象。DNA條形碼鑒定是依靠物種的種間基因遺傳差異比種內(nèi)基因遺傳差異大進(jìn)行區(qū)分的，而棉鈴蟲與煙青蟲遺傳交流比較多，因此它們在NJ樹上聚為一類，線粒體COⅠ基因很好地反映了這個事實。大三角魯夜蛾和兀魯夜蛾也有類似情況。乏夜蛾Niphonyx segregate(Butler)中編號為LJZ100726.357的樣本在NJ樹上為單獨一支，可能由于基因雜交或樣本問題，這有待進(jìn)一步研究。

圖1 通過鄰接法和支持向量機在夜蛾科COⅠ序列數(shù)據(jù)集物種鑒定的成功率(未加入舟蛾數(shù)據(jù)集)Fig.1 Success rate in species identification，based on the COⅠ gene，using either the SVM or NJ，performed on the non-joined Noctuoidea dataset

3 討論

本研究中，鄰接法(Mailund et al.，2006)在數(shù)據(jù)集Ⅱ和數(shù)據(jù)集Ⅲ的成功率都為90%左右，而支持向量機的成功率為83%左右，兩者都有很高的成功率。這驗證了DNA條形碼在分類學(xué)上的應(yīng)用價值。已有證據(jù)表明，COⅠ序列在某些類群或者某個地區(qū)內(nèi)有很好的鑒別能力，如COⅠ序列鑒定熱帶鱗翅目昆蟲的成功率達(dá)到97.9%(Hajibabaei et al.，2006)。

DNA條形碼作為一種新興技術(shù)，在對物種分類識別上具有快捷、簡單的優(yōu)點。前人已有DNA條形碼與機器學(xué)習(xí)方法相結(jié)合的研究，在2008年Zhang et al.將人工智能的思想引入DNA分子分類學(xué)領(lǐng)域，提出了基于BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的物種鑒定新方法。本研究將DNA條形碼與支持向量機結(jié)合證明了DNA條形碼在樣品鑒定中具有較高的準(zhǔn)確性。雖然現(xiàn)在普遍應(yīng)用的鄰接法(Mailund et al.，2006)的成功率比支持向量機高，但是隨著分子技術(shù)的不斷更新，生物信息數(shù)據(jù)量不斷擴(kuò)增，將有越來越多的人依賴人工智能的方法對數(shù)據(jù)進(jìn)行查詢。因此，本研究也是對數(shù)據(jù)查詢方法的一種探索。DNA條形碼快速識別數(shù)據(jù)網(wǎng)絡(luò)的建立，將為以后的研究提供便利，也給生物多樣性研究創(chuàng)造了有利條件。

圖2 基于數(shù)據(jù)集Ⅱ的COⅠ序列構(gòu)建的部分夜蛾種類的NJ樹Fig.2 NJ-tree of 55 slected Noctuidae species based on the COⅠ gene of database Ⅱ

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