辣椒堿對煙粉虱體內(nèi)羧酸酯酶、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶和乙酰膽堿酯酶活性的影響

吳咚咚，趙建偉，陳 穎，鄭 宇，何玉仙*福州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，福建福州5008;福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所，福建福州500;泉州市農(nóng)業(yè)局，福建泉州6000

煙粉虱Bemisia tabaci Gennadius是一種世界性分布的多食性害蟲，其中，B型煙粉虱幾乎在全世界均有分布，其他生物型多為區(qū)域性分布(段曉東等，2011)。據(jù)估計，目前煙粉虱的寄主植物種類已超過600種(Oliveira et al.，2001)。B 型煙粉虱對不同寄主植物的選擇性有明顯差異，對辣椒Capsicum annuum L.韌皮部極不適應(yīng)，不能持續(xù)吸食(曹鳳勤等，2008;吳青君等，2004;岳梅等，2006)。趙建偉等(2009)研究發(fā)現(xiàn)，辣椒不是B型煙粉虱的適宜寄主，B型煙粉虱若蟲甚至無法在辣椒上存活并完成世代發(fā)育。

辣椒堿作為辣椒屬植物的次級代謝產(chǎn)物，是一種極度辛辣的香草酰胺類生物堿，具有抗菌、殺蟲的藥理作用，對桃蚜Myzus persicae(Sulzer)具有較強的毒力和良好的防治效果(馮紀年等，2005;李家玉等，2009;劉新和林永，2003)。趙建偉等(2011)研究表明，辣椒堿對煙粉虱各蟲態(tài)均有直接的致死作用。植食性昆蟲常依靠其體內(nèi)具普遍防御性的酶系(如微粒體多功能氧化酶、酯酶和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶)來克服其食物中的潛在毒性(姚洪渭等，2002)。而植物次生物質(zhì)可激活或抑制害蟲體內(nèi)相關(guān)解毒酶系的活性，從而導(dǎo)致其對藥劑的敏感性發(fā)生明顯改變(Brattsten，1988)。辣椒堿作為新型綠色農(nóng)藥，對防除蚜蟲和煙粉虱等農(nóng)業(yè)害蟲具有良好的效果，可代替生產(chǎn)上常用的毒性大、殘留量高的有機磷、有機氯、氨基甲酸酯類化學(xué)農(nóng)藥，對于降低化學(xué)農(nóng)藥殘留和保護生態(tài)環(huán)境具有重要意義。本文主要研究以辣椒堿不同劑量處理后不同時段煙粉虱體內(nèi)解毒酶、靶標酶活性的變化情況，以期闡明辣椒堿殺蟲活性的生化機制，為煙粉虱的抗藥性治理和辣椒堿在生物農(nóng)藥領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試寄主植物 棉花Gossypium hirsutum L.種子由福州永菜種子有限公司提供，試驗前種植于育苗室，常規(guī)水肥管理，全生育期未施農(nóng)藥。

1.1.2 供試昆蟲 煙粉虱為福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所室內(nèi)(溫度25℃，相對濕度65%，光照14L∶10D)長期飼養(yǎng)的試驗種群，經(jīng)鑒定為B型(何玉仙等，2006a)。

1.1.3 供試藥劑 98%辣椒堿由陜西森弗生物技術(shù)有限公司提供，α-乙酸萘酯(α-NA，99.95%)由中國上海青浦合成試劑廠提供，固藍RR鹽(Fast Blue RRsalt)由廈門泰京生物技術(shù)有限公司提供，碘化硫代乙酰膽堿(ATChI)由Fluka公司提供，二硫代雙對硝基苯甲酸(DTNB)由上?；瘜W(xué)試劑廠提供，還原型谷胱甘肽(GSH)由上海生工生物工程有限公司提供，考馬斯亮藍G-250由中國醫(yī)藥集團上?；瘜W(xué)試劑分公司提供;其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 辣椒堿對煙粉虱成蟲的毒力測定 采用成蟲浸葉生測法(何玉仙等，2006b)進行測定。用打孔器將未被藥劑污染的新鮮棉花葉打成直徑35 mm的小圓片，將小圓片分別浸入用去離子水(含0.1%Triton X-100)配制的濃度為 500、1000、2000、4000和8000 mg·L-1的供試藥液中，5 s后取出，自然晾干后葉片正面朝下鋪在直徑為35 mm的培養(yǎng)皿中(預(yù)先倒入12 g·L－1瓊脂)。將煙粉虱雌成蟲用CO2短暫麻醉后，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿放20～30頭，蓋上具透氣網(wǎng)的蓋子，并將其倒置于溫度25℃、相對濕度65%、光照14∶10(L∶D)的培養(yǎng)箱中，48 h后統(tǒng)計死亡率。每個濃度設(shè)3次重復(fù)，以去離子水(含0.1%Triton X-100)處理為對照。采用DPS統(tǒng)計軟件求出毒力回歸方程、LC50及95%置信限。

1.2.2 辣椒堿對煙粉虱體內(nèi)酶活性的影響測定以 500、1000、2000、4000 和 8000 mg·L－1辣椒堿溶液處理煙粉虱雌成蟲(方法同1.2.1)，分別于處理后1、3、6、12、24、48 h 挑取存活試蟲備用。

(1)羧酸酯酶(carboxylesterase，CarE)活性測定:每個處理挑取100頭煙粉虱雌成蟲置于1.5 mL Eppendorf管中，加入 1.0 mL 0.2 mol·L－1磷酸緩沖液(pH 6.0)，在冰浴中充分勻漿后，4 ℃、10000 r·min－1條件下離心10 min，取上清液稀釋10倍作為酶源(何玉仙等，2007)。

(2)谷光甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase，GSTs)活性測定:每個處理挑取100頭煙粉虱雌成蟲置于 1.5 mL Eppendorf管中，加入 1.0 mL 0.06 mol·L－1磷酸緩沖液(pH 7.0)，在冰浴中充分勻漿后，4 ℃、10000 r·min－1條件下離心10 min，取上清液作為酶源(何玉仙等，2007)。

(3)乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase，AChE)活性測定:每個處理挑取100頭煙粉虱雌成蟲置于1.5 mL Eppendorf管中，加入 1.0 mL 0.1 mol·L－1含0.1%Triton X-100 的磷酸緩沖液(pH 7.5)，在冰浴中充分勻漿后，4 ℃、10000 r·min－1條件下離心10 min，取上清液稀釋5倍作為酶源(何玉仙等，2008)。

(4)酶源蛋白質(zhì)含量測定:采用考馬斯亮藍G-250染色法(Bradford，1976)進行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒堿對煙粉虱成蟲的毒力

辣椒堿對煙粉虱成蟲具有明顯的致死作用，辣椒堿作用24 h的毒力回歸方程為Y=4.8775X－12.3018，R2為 0.9946，LC50為 3525.79 mg·L－1，95%置信區(qū)間為3191.68 ～3849.78 mg·L－1。

2.2 辣椒堿對煙粉虱體內(nèi)CarE活性的影響

辣椒堿對煙粉虱體內(nèi)CarE活性的影響見圖1。500 mg·L－1辣椒堿處理煙粉虱成蟲后1 ～3 h，CarE活性受到抑制;處理后6 h活性被激活而高于對照;處理后12～48 h活性再次受到抑制。1000 mg·L－1辣椒堿處理后1～3 h，CarE活性被激活;處理后6～12 h活性受到抑制而低于對照;處理后24～48 h又產(chǎn)生一個激活和抑制的波動。2000 mg·L－1辣椒堿處理后1～3 h，CarE活性被激活;處理后6 h活性受到抑制;處理后12～48 h活性被激活而高于對照，48 h時活性達到最高。4000 mg·L－1辣椒堿處理后1、6、24和48 h CarE活性被激活而高于對照;處理后3和12 h活性受到抑制。8000 mg·L－1辣椒堿處理后1 h CarE活性被激活;處理后3～48 h活性受到抑制?？梢?，辣椒堿對煙粉虱體內(nèi)CarE活性存在一個誘導(dǎo)激活與抑制反饋反復(fù)作用的過程。

2.3 辣椒堿對煙粉虱體內(nèi)GSTs活性的影響

辣椒堿對煙粉虱體內(nèi)GSTs活性的影響見圖2。8000 mg·L－1辣椒堿處理煙粉虱成蟲后24～48 h，4000 mg·L－1辣椒堿處理煙粉虱成蟲后6 h GSTs活性受到明顯抑制。其余各處理GSTs活性均被激活而高于對照，但被激活程度隨處理時間的延長而波動。

圖1 不同濃度辣椒堿對煙粉虱體內(nèi)CarE活性的影響Fig.1 Effects of capsaicin at defferent concentrations on CarE activity in B.tabaci

圖2 不同濃度辣椒堿對煙粉虱體內(nèi)GSTs活性的影響Fig.2 Effects of capsaicin at defferent concentrations on GSTs activity in B.tabaci

2.4 辣椒堿對煙粉虱體內(nèi)AChE活性的影響

辣椒堿對煙粉虱體內(nèi)AChE活性的影響見圖3。各濃度辣椒堿對煙粉虱體內(nèi)AChE活性存在時間效應(yīng)，均在處理后48 h對AChE活性產(chǎn)生了抑制作用。其中，500 mg·L－1辣椒堿處理煙粉虱成蟲后1 h，AChE活性受到抑制;處理后3～12 h活性被激活而高于對照;處理后24～48 h AChE活性再次受到抑制。1000和8000 mg·L－1辣椒堿處理后1 h，AChE活性受到抑制;處理后3～24 h其活性被激活而高于對照;處理后48 h再次受到抑制。2000 mg·L－1辣椒堿處理后1 ～12 h，AChE 活性被激活;而處理后 24～48 h其活性受到抑制。4000 mg·L－1辣椒堿處理后1～6 h，AChE活性被激活;處理后12～48 h活性受到抑制。

圖3 不同濃度辣椒堿對煙粉虱體內(nèi)AChE活性的影響Fig.3 Effects of capsaicin at defferent concentrations on AChE activity in B.tabaci

3 小結(jié)與討論

害蟲的抗藥性問題已逐漸成為影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要因素之一，化學(xué)藥劑的過量使用不僅提高了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本，而且增大了食品安全風(fēng)險。因此，尋求化學(xué)防治之外的新技術(shù)就成為害蟲綜合治理領(lǐng)域的新熱點。植物體內(nèi)的部分次生代謝物質(zhì)具有一定的殺蟲活性，且這些物質(zhì)在長期的進化過程中已經(jīng)形成了固定的參與能量與物質(zhì)循環(huán)的代謝途徑，因此，在實際使用中不易產(chǎn)生殘留及生物富集現(xiàn)象，害蟲不易產(chǎn)生抗藥性(李慕春等，2010)。目前，許多植物源生物堿已被作為殺蟲劑開發(fā)利用，如苦參堿、苦豆堿、小檗堿、百部堿等。

已有研究表明，野靛堿和苦豆堿、葫蘆素B均對煙粉虱體內(nèi)的CarE活性具有抑制作用(羅萬春和張強，2003;張愛萍等，2008)，而槲皮素對B型煙粉虱成蟲體內(nèi)CarE有誘導(dǎo)增多作用(牟少飛等，2006)。雷公藤生物堿也可顯著激活粘蟲Mythimna seperata(Walker)體內(nèi)的CarE活性(周琳等，2008)。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)500、1000、2000、4000 mg·L－1辣椒堿處理后，煙粉虱體內(nèi)CarE活性隨著處理時間的延長呈現(xiàn)一種波動狀態(tài)，說明較低劑量辣椒堿對CarE可能存在一個誘導(dǎo)激活與抑制反饋反復(fù)作用的過程;而在高劑量(8000 mg·L－1)處理后1 h，CarE活性被激活，隨后時段則受到抑制。據(jù)此推斷，植物源生物堿對害蟲體內(nèi)CarE活性的影響可能與生物堿的處理劑量和處理時間密切相關(guān)。

陳列忠等(2005)研究發(fā)現(xiàn)，在亞致死質(zhì)量濃度下，雷公藤總生物堿可顯著抑制搖蚊Chironomidae體內(nèi)的GSTs活性。而周琳等(2008)報道，雷公藤生物堿對GSTs活性的影響表現(xiàn)為先激活后抑制。劉少武等(2008)研究表明，辣椒堿能夠抑制昆蟲體內(nèi)的GSTs活性，降低其催化解毒能力，從而減弱害蟲對藥劑的抵抗力，但其并不能夠完全抑制GSTs活性，且不同濃度辣椒堿對GSTs抑制能力的差異呈不規(guī)則變化。本研究表明，辣椒堿對煙粉虱體內(nèi)GSTs活性的誘導(dǎo)存在劑量和時間效應(yīng)，低濃度可誘導(dǎo)GSTs活性增強，說明煙粉虱對低劑量的辣椒堿存在解毒機制，即GSTs活性的增強加大了其對辣椒堿的代謝作用，這是煙粉虱對外界刺激的一種適應(yīng)機制。但高濃度的辣椒堿對煙粉虱有較強的毒害作用并抑制了GSTs活性，因此，高劑量(8000 mg·L－1)處理后短時間內(nèi)可誘導(dǎo)GSTs活性增高，24 h后則表現(xiàn)較強的抑制作用。

AChE是動物體內(nèi)廣泛存在的在神經(jīng)傳遞過程中起重要作用的一種酶，此酶一旦被抑制達一定程度時，會使動物過度興奮而死亡(唐培安等，2007)。據(jù)報道，苦豆子總生物堿、野靛堿、槐安堿、槐堿、槐果堿、氧化苦參堿、苦參堿和苦豆堿、石松生物堿對AChE活性均具有抑制作用(羅萬春等，1997;徐莉娜等，2007)?？鄥A可明顯抑制小菜蛾P(guān)lutella xyllostella(L.)體內(nèi)的AChE活性，造成其神經(jīng)興奮傳導(dǎo)受阻(黃勁飛等，2010);煙堿對害蟲的毒殺機制是抑制乙酰膽堿受體(AChR)，持續(xù)激活神經(jīng)，使蟲體持續(xù)痙攣，麻痹死亡(吳瓊等，2011)。本研究表明，各濃度辣椒堿在處理后36～48 h煙粉虱體內(nèi)的AChE活性均受到抑制，存在明顯的時間效應(yīng)。這與劉少武和紀明山(2008)的研究結(jié)果一致。但AChE是否為辣椒堿的一個作用位點還有待進一步研究確定。

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