高山杜鵑花苞組織培養(yǎng)和優(yōu)化體系的建立

王蔚瓊，肖建忠* ，李志斌，胡建敏，白霄霞

(1河北農(nóng)業(yè)大學(xué)園林與旅游學(xué)院，河北保定，071001;2石家莊市農(nóng)林科學(xué)研究院)

高山杜鵑(Rhododendron lapponicum)為杜鵑花科杜鵑屬，屬于常綠灌木，原產(chǎn)我國中西部地區(qū)的高山密林中，后由德國、比利時等國引種栽培馴化，并改良選育出許多優(yōu)良品種;一個花苞中有十幾朵小花，呈球形開放，艷麗華貴，深受人們喜愛［1～3］。高山杜鵑枝粗葉少，無種子，通?？壳げ宸敝常?］，但生長周期長，繁殖系數(shù)低，扦插成活率低，同時受母株材料和繁殖季節(jié)影響，常規(guī)的繁殖方法無法滿足高山杜鵑目前的需求［5］。而通過組織培養(yǎng)，則繁殖速度快，繁殖系數(shù)高［6］，不受季節(jié)影響，對優(yōu)良品種的引進(jìn)和推廣有重大意義。我國從20世紀(jì)80年代開始杜鵑組織培養(yǎng)的研究，目前有秦靜遠(yuǎn)等［7］以葉片為外植體，通過脫分化、再分化途徑獲得了完整植株，而 Lapichino，John E．Preece 和 Miles R．lmel等［8～11］直接從葉片上得到叢生芽;楊乃博［12，13］、闕國寧［14］、董春枝等［15］、陳振光等［16］對春夏鵑、錦繡杜鵑和西洋杜鵑的少數(shù)品種進(jìn)行過組織培養(yǎng)研究;湯桂鈞等［17，18］曾用莖尖和莖段作為外植體，對部分品種進(jìn)行快繁，掌握高山杜鵑組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)體系;但有關(guān)高山杜鵑用花苞作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)的還未見報道。筆者擬利用花苞為外植體，對高山杜鵑“粉冠博士”進(jìn)行快速繁殖，為工廠化育苗提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 供試材料

試驗材料由河北省石家莊市農(nóng)林科學(xué)研究院提供，為高山杜鵑“粉冠博士”品種。

1．2 外植體準(zhǔn)備

高山杜鵑花苞一般在9月份發(fā)育成熟，之后處于休眠狀態(tài)，一般到次年的2月份開始萌動。因此，選取12月份長勢旺盛的花苞作為外植體，然后在無菌室超凈工作臺上取出花苞中單個小花苞，用體積分?jǐn)?shù)為0．75的酒精浸泡30 s，用無菌水沖洗3遍;再用質(zhì)量濃度為1．0 g/L的升汞浸泡30 s，最后用無菌水沖洗5遍，放于無菌棉紗布涼干以備接種用。

1．3 無菌培養(yǎng)系的建立

外植體誘導(dǎo)初始無菌芽的培養(yǎng)基為:

(A)MS+IAA 1．0 mg/L+KT 12 mg/L

(B)WPM+IAA 1．0 mg/L+KT 12 mg/L

(C)Anderson+IAA 1．0 mg/L+KT 12 mg/L

3種培養(yǎng)基中蔗糖的質(zhì)量濃度為30 g/L，倍立凝的質(zhì)量濃度為10 g/L，pH值為6．0～6．3，培養(yǎng)室溫度為(23±1)℃，光照度為2 000－3 000 lx，每天光照時間為12 h。每個處理15瓶，每瓶2個小花苞，重復(fù)3次。45，60 d后統(tǒng)計芽的誘導(dǎo)率。

1．4 繼代增殖培養(yǎng)

將誘導(dǎo)出的長度大于0．8 cm的不定芽進(jìn)行繼代培養(yǎng)。增殖培養(yǎng)基為:以Anderson為基本培養(yǎng)基，添加的生長調(diào)節(jié)劑為IAA和KT，具體處理見表1。

培養(yǎng)期間光溫條件與“1．3無菌培養(yǎng)系的建立”中的初代培養(yǎng)階段相同。每個處理10瓶，每瓶1個不定芽，3次重復(fù)。統(tǒng)計分化率、增殖系數(shù)、玻璃化程度。

分化率=(分化外植體數(shù)/外植體總數(shù))×100%

增殖系數(shù)=芽總數(shù)/產(chǎn)生芽外植體數(shù)

玻璃化程度:1，＜5%;2，5% ～15%;3，＞15%。

1．5 生根培養(yǎng)

1．5．1 不同生長素對高山杜鵑生根的影響 將在Anderson+IAA 1．0 mg/L+KT 3．0 mg/L培養(yǎng)基上長度達(dá)到3 cm，葉片4葉以上、葉色深綠、健壯的芽進(jìn)行生根培養(yǎng)。

生根培養(yǎng)基為:以1/2 Anderson為基本培養(yǎng)基，添加的生長調(diào)節(jié)劑為NAA和IAA，具體處理見表2。

培養(yǎng)期間光溫條件與“1．3無菌培養(yǎng)系的建立”中的初代培養(yǎng)階段相同。每個處理10瓶，每瓶2株，3次重復(fù)。40 d統(tǒng)計生根率。

表1 高山杜鵑繼代增殖培養(yǎng)的不同生長調(diào)節(jié)劑處理

表2 高山杜鵑生根培養(yǎng)的不同生長調(diào)節(jié)劑處理

1．5．2 活性炭(AC)對高山杜鵑組培苗生根的影響 切取生長旺盛，長勢大體一致的芽(長度2～3 cm)，分別接種于Anderson(大量減半)+IAA 4．0 mg/L和Anderson(大量減半)+IAA 4．0 mg/L+AC 3．0 mg/L的生根培養(yǎng)基上，每個處理10瓶，每瓶2株，3次重復(fù)。1個月后觀察根長勢情況，統(tǒng)計生根率。

1．6 組培苗的煉苗移栽

將生根的組培苗的瓶口打開，在培養(yǎng)室散射光下進(jìn)行開口煉苗，使嫩苗逐漸和外界接觸，提高適應(yīng)能力，一周后取出單苗，洗凈根上帶的培養(yǎng)基，把根在質(zhì)量濃度為2．0 g/L的多菌靈溶液中浸泡3 min，栽入以下不同基質(zhì)中，觀察組培苗的生長情況。

移栽基質(zhì)為:1，國產(chǎn)草炭;2，進(jìn)口草炭;3，v國產(chǎn)草炭∶v進(jìn)口草炭=1∶1;4，v進(jìn)口草炭∶v珍珠巖=3∶1。

移栽前將基質(zhì)澆透水，移栽后葉面噴水，用塑料薄膜覆蓋，相對空氣濕度在70% ～90%之間，20 d后觀察記錄其生長狀況并統(tǒng)計成活率。

2 結(jié)果與分析

2．1 初始無菌培養(yǎng)系的建立

從芽誘導(dǎo)率來看，C培養(yǎng)基中芽誘導(dǎo)率顯著高于其它兩種培養(yǎng)基，45 d時芽誘導(dǎo)率達(dá)到57．8%，60 d時芽誘導(dǎo)率達(dá)到74．5%(表3)。且C培養(yǎng)基中芽生長狀況相對優(yōu)于A，B培養(yǎng)基中芽生長狀況。因此，C培養(yǎng)基最適宜于花苞的啟動培養(yǎng)，即Anderson+IAA 1．0 mg/L+KT 12 mg/L。

表3 不同培養(yǎng)基對花苞啟動培養(yǎng)的影響

2．2 繼代增殖培養(yǎng)

當(dāng)KT的質(zhì)量濃度為0．5 mg/L，IAA的質(zhì)量濃度為0．1～1．0 mg/L時，芽的增殖系數(shù)低，長勢一般;而當(dāng)KT的質(zhì)量濃度為3．0 mg/L，IAA的質(zhì)量濃度為0．1～1．0 mg/L時，芽的增殖十分明顯，增殖系數(shù)為5．50～6．96(表4)。尤其當(dāng)KT的質(zhì)量濃度為3．0 mg/L，IAA的質(zhì)量濃度為1．0 mg/L時，增殖系數(shù)達(dá)6．96，且芽的長勢粗壯;而當(dāng)KT的質(zhì)量濃度提高至5．0 mg/L時，增殖系數(shù)為7．15～8．19，但芽長勢細(xì)弱、葉色黃綠、部分芽成一堆狀，主莖不明顯，并且玻璃化程度嚴(yán)重，不利于繼代增殖。經(jīng)方差分析，KT的質(zhì)量濃度為0．5 mg/L時的增殖系數(shù)與KT的質(zhì)量濃度為3．0，5．0 mg/L的增殖系數(shù)差異顯著(P＜0．05)。而各亞處理間的分化率無顯著差異。綜合各因素，最適宜繼代增殖的培養(yǎng)基為Anderson+IAA 1．0 mg/L+KT 3．0 mg/L。

表4 不同生長調(diào)節(jié)劑組合對組培苗增殖培養(yǎng)的影響

2．3 生根培養(yǎng)

2．3．1 不同生長素對高山杜鵑生根的影響 木本觀賞植物里，一些種類，IBA不僅促進(jìn)生根效果好，而且根的進(jìn)一步生長較正常;另一些種類，IAA和NAA也被廣泛應(yīng)用［19］。以1/2 Anderson為基本培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中分別添加不同質(zhì)量濃度的NAA和IAA，經(jīng)過40 d培養(yǎng)后統(tǒng)計生根率。結(jié)果表明，10個處理中10號處理的生根率最高，為96．7%(表5);5號處理的生根率最低，僅為10%。在這10個處理中可以發(fā)現(xiàn)，含有IAA的處理中，生根率普遍高于含有NAA的。含有NAA的5個處理中，生根率最高僅達(dá)到43．3%，且生根狀況一般，根較細(xì)。而含IAA的5個處理中，生根率最高達(dá)96．7%，且根系發(fā)達(dá)，根苗壯。這說明在高山杜鵑的生根培養(yǎng)中，IAA比NAA能更好的促進(jìn)植株生根。

對組培苗生根率的統(tǒng)計分析顯示，1/2 Anderson+IAA 4．0 mg/L培養(yǎng)基與其他9種培養(yǎng)基相比，差異顯著(P＜0．05)。綜合各因素，最適宜高山杜鵑“粉冠博士”生根的培養(yǎng)基為1/2 Anderson+IAA 4．0 mg/L。

表5 不同生長素對高山杜鵑組培苗生根培養(yǎng)的影響

2．3．2 活性炭(AC)對高山杜鵑組培苗生根的影響 AC能吸附培養(yǎng)基中的有害物質(zhì)，因此對組培材料的生根有利，但其又能吸附培養(yǎng)基中的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)和其它成分，不利于生根［20］。在本次試驗中活性炭對高山杜鵑的生根率基本上沒影響(表6)，可能是由于活性炭對植物生根正負(fù)兩方面的作用相互抵消的結(jié)果。但是它對于根的形態(tài)、生長狀況有影響。有活性炭的培養(yǎng)基上的幼苗的根生長整齊，形態(tài)正常;無活性炭的培養(yǎng)基上的幼苗的根則不如有活性炭的培養(yǎng)基上的根整齊，這可能是因為培養(yǎng)基中生長素未被吸附，濃度較高的緣故。

表6 活性炭(AC)對高山杜鵑組培苗生根的影響

表7 基質(zhì)對移栽苗成活率的影響

2．4 組培苗的煉苗移栽

不同基質(zhì)對移栽成活有一定的影響(表7)。最有利于高山杜鵑“粉冠博士”組培苗移栽存活的基質(zhì)類型為進(jìn)口草炭和珍珠巖按體積比為3∶1的混合物，其次是進(jìn)口草炭，再次是國產(chǎn)草炭和進(jìn)口草炭按體積比為1∶1的混合物，最后是國產(chǎn)草炭。

3 討 論

個別高山杜鵑品種的組織培養(yǎng)研究有過報道［5，17，18］，由于品種很多，所以用于組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基、激素和添加物也比較多，本次試驗僅研究了一個品種的培養(yǎng)基配比，所選出的最適培養(yǎng)基配方是否適用于其它品種有待進(jìn)一步研究。

本次試驗中確定了高山杜鵑“粉冠博士”組培繁殖的最適培養(yǎng)基，但無菌苗在繼代過程中，隨著繼代次數(shù)的增加，植物激素在無菌苗體有量的積累過程，細(xì)胞分裂素的量過大，雖然也分化許多叢生芽，但芽的質(zhì)量發(fā)生了變化，可能出現(xiàn)徒長現(xiàn)象，莖細(xì)嫩、顏色淡綠，所以繼代次數(shù)多的情況下可以考慮適量減少激素的用量。本次試驗還發(fā)現(xiàn)，雖然在高山杜鵑誘導(dǎo)過程中有玻璃化苗出現(xiàn)，但隨著時間的推移，增加轉(zhuǎn)接次數(shù)，玻璃化苗逐漸變?yōu)檎Ｃ纾皇敲缳|(zhì)量欠佳。所以，減少玻璃化現(xiàn)象是高山杜鵑組培中一項需要解決的問題。

在應(yīng)用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行觀賞植物的快速繁殖中，繁殖系數(shù)是決定組培苗生產(chǎn)效益和成本的一個重要因素［17］。本次試驗中發(fā)現(xiàn)，繁殖系數(shù)的高低主要取決于培養(yǎng)基中KT的用量，培養(yǎng)室溫度的高低也有一定的調(diào)節(jié)作用。繁殖系數(shù)隨KT濃度的提高而提高，但KT濃度過高，培養(yǎng)的組培苗細(xì)弱、主莖不明顯、成一堆狀、容易形成玻璃苗。本次研究中，為保證組培苗的質(zhì)量，當(dāng)培養(yǎng)獲得叢生芽后，以Anderson+IAA 1．0 mg/L+KT 3．0 mg/L的培養(yǎng)基進(jìn)行增殖培養(yǎng)效果較好。

試驗中發(fā)現(xiàn)，將試管無根新梢置于Anderson即全量元素配方，不添加任何生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基上壯苗培養(yǎng)1個月后再進(jìn)行生根培養(yǎng)，對提高組培苗的質(zhì)量及生根率具有促進(jìn)作用，與湯桂鈞等［17］對高山杜鵑“火箭”的研究中得出的結(jié)果一致。

組織培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用成敗在很大程度上取決于組培苗移栽的成活率，移栽的基質(zhì)是影響成活率的一個因素，基質(zhì)透水性太好有利于移栽前期成活率的提高但不利于種苗的后期生長，對基質(zhì)保肥不利，增加管理成本。試驗表明，進(jìn)口草炭、珍珠巖(體積比3∶1)比較適合，但移栽階段的培養(yǎng)基質(zhì)的設(shè)計不盡完善，目的性不強，至少應(yīng)加國產(chǎn)草炭+珍珠巖)，這樣比較用進(jìn)口草炭與國產(chǎn)草炭及與其它基質(zhì)不同比例混合后的效果，從而選擇成活率高、成本較低的配比種類。所以，在以后的研究中有待進(jìn)一步完善。

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圖版說明:A，B為花苞外植體;C，D為花苞的啟動培養(yǎng);E，F(xiàn)為增殖培養(yǎng);G為壯苗培養(yǎng);H為生根培養(yǎng);I，J為煉苗移栽。