高效液相色譜法測(cè)定酸奶和液體奶中對(duì)羥基苯甲酸酯類的研究

文 / 梁 艷 呂海燕 劉麗君 李翠枝 王艷萍 任新志 邵振國(guó)

（內(nèi)蒙古伊利集團(tuán)實(shí)業(yè)股份有限公司）

對(duì)羥基苯甲酸酯類，又稱尼泊金酯，因其低毒、非揮發(fā)性、良好的殺菌能力和穩(wěn)定性，而被用作食品防腐劑。Routledge等[1]首次發(fā)現(xiàn)對(duì)羥基苯甲酸酯具有雌激素活性，對(duì)消費(fèi)者的身心健康嚴(yán)重不利。衛(wèi)生部規(guī)定了食品中對(duì)羥基苯甲酸酯類的添加限量[2]和醬油、醋、水果汁及果醬中對(duì)羥基苯甲酸酯類的測(cè)定方法[3]，也有一些地方標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中對(duì)羥基苯甲酸酯類的測(cè)定方法，即高效液相色譜法[4]，但乳制品中對(duì)羥基苯甲酸酯類尚無(wú)國(guó)家衛(wèi)生檢驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定方法。

鑒于此，本實(shí)驗(yàn)建立了簡(jiǎn)便、快速的酸奶和液體奶前處理方法，以及分析對(duì)羥基苯甲酸乙酯（EP）和對(duì)羥基苯甲酸丙酯（PP）的液相色譜法。該方法分離效果好，抗干擾能力強(qiáng)，且定量較準(zhǔn)確，是檢測(cè)這兩種防腐劑的一種較為理想的方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

配有紫外檢測(cè)器的高效液相色譜儀；超聲波；甲醇、無(wú)水乙醇，為色譜純；冰乙酸為優(yōu)級(jí)純；對(duì)羥基苯甲酸酯類標(biāo)準(zhǔn)品：對(duì)羥基苯甲酸乙酯和對(duì)羥基苯甲酸丙酯，純度≥99%。

圖1 對(duì)羥基苯甲酸酯類標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖（標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為10.0 μg/mL）

1.2 色譜條件

色譜柱：C18柱，5 μm，4.6 mm×250 mm；流動(dòng)相：甲醇-水-乙酸（體積比為60∶40∶5）；檢測(cè)波長(zhǎng)：256 nm。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制

將對(duì)羥基苯甲酸乙酯和對(duì)羥基苯甲酸丙酯用無(wú)水乙醇配成1.0 mg/mL的混標(biāo)貯備液，按實(shí)際檢測(cè)要求，用無(wú)水乙醇稀釋到相應(yīng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，濃度系列為1.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL、20.0 μg/mL和40.0 μg/mL。1.3.2 樣品前處理

稱取約10 g（精確至0.1 mg）樣品于50 mL容量瓶中，加入30 mL甲醇超聲提取30 min，冷至室溫后用水定容。冷凍1 h后過(guò)濾，取濾液過(guò)0.2 μm的濾膜，上機(jī)測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的確定

對(duì)羥基苯甲酸酯類難溶于水，易溶于乙醇、甲醇等有機(jī)溶劑。本實(shí)驗(yàn)分別選用乙醇、甲醇[5]作為提取溶劑進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，用甲醇提取的回收率要遠(yuǎn)高于用乙醇提取的回收率。因此，確定甲醇為對(duì)羥基苯甲酸酯類的提取溶劑。

2.2 柱子的選擇

本實(shí)驗(yàn)分別選用150 mm和250 mm的柱子對(duì)對(duì)羥基苯甲酸酯類的混標(biāo)進(jìn)行分離，結(jié)果表明，150 mm的柱子和250 mm的柱子均可以將對(duì)羥基苯甲酸酯類的混標(biāo)分開(kāi)，但是在用150 mm的柱子進(jìn)行分離時(shí)，兩種對(duì)羥基苯甲酸酯類的出峰時(shí)間較早，而且相隔很近。為了便于對(duì)樣品中的對(duì)羥基苯甲酸酯類進(jìn)行很好地分離，本實(shí)驗(yàn)采用250 mm的柱子進(jìn)行分離。

表1 對(duì)羥基苯甲酸酯類的線性范圍、線性方程和檢出限

表2 酸奶和液體奶的添加回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍

對(duì)羥基苯甲酸酯類的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液用無(wú)水乙醇稀釋定容，配制對(duì)羥基苯甲酸酯類標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度系列分別為1.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL、20.0 μg/mL和40.0 μg/mL。對(duì)羥基苯甲酸酯類標(biāo)準(zhǔn)品通過(guò)高效液相色譜進(jìn)行分析，檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。結(jié)果表明，在甲醇-水-乙酸為流動(dòng)相條件下，對(duì)羥基苯甲酸乙酯的出峰時(shí)間為5.42 min，對(duì)羥基苯甲酸丙酯的出峰時(shí)間為8.12 min，而且分離效果較好。

根據(jù)色譜圖中各組分的峰面積與其質(zhì)量濃度進(jìn)行回歸，得出回歸方程和相關(guān)系數(shù)，結(jié)果如表1所示，其中Y代表峰面積，X代表進(jìn)樣的質(zhì)量濃度（μg/mL）。由表1可知，對(duì)羥基苯甲酸乙酯和對(duì)羥基苯甲酸丙酯的濃度分別在1～40 μg/mL的線性范圍內(nèi)時(shí)，線性關(guān)系良好。

2.4 回收率測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)對(duì)酸奶和液體奶中對(duì)羥基苯甲酸酯類的回收率進(jìn)行了測(cè)定。在酸奶和液體奶樣品中分別加入1 mg/mL、1.8 mg/mL和10 mg/mL的對(duì)羥基苯甲酸酯類混合標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表2所示。從表2可以看出，對(duì)羥基苯甲酸乙酯的回收率在97.2%～102%之間，對(duì)羥基苯甲酸丙酯的回收率在96.9%～102%之間，這說(shuō)明該方法的加標(biāo)回收率很好。

2.5 實(shí)際樣品的檢測(cè)

本實(shí)驗(yàn)對(duì)酸奶和液體奶的20 批次樣品進(jìn)行了檢測(cè)，這些樣品中均不含對(duì)羥基苯甲酸酯類，故對(duì)其進(jìn)行了加標(biāo)檢測(cè)，結(jié)果表明該方法的平行性良好，符合實(shí)驗(yàn)要求。

3 結(jié)論

本方法以標(biāo)準(zhǔn)樣品的保留時(shí)間定性，外標(biāo)法定量，進(jìn)行了酸奶和液體奶中對(duì)羥基苯甲酸酯類含量的測(cè)定。采用該方法能夠準(zhǔn)確定量測(cè)定酸奶和液體奶中對(duì)羥基苯甲酸酯類的含量，而且簡(jiǎn)便、快速、靈敏，重現(xiàn)性較好。該方法不僅是測(cè)定酸奶和液體奶中對(duì)羥基苯甲酸酯類含量的有效方法，而且也可以為乳制品中其它防腐劑的分析測(cè)定奠定基礎(chǔ)。

[1] Parker J，Odum J，Ashby J，et al. Some atkylh benzoate preservatives（parabens）are estrogenic. Toxicolo Applied Pharmacology，1998，153（1）：12-19.

[2] GB 2760-2007 食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn).[3] GB/T 5009.31-2003 食品中對(duì)羥基苯甲酸酯類的測(cè)定.

[4] DB37/T 1100-2008 食品中對(duì)羥基苯甲酸酯類的測(cè)定 高效液相色譜法.

[5] 陳皚，何喬桑，王萍亞，等. 固相萃取—高效液相色譜法測(cè)定水果和果醬中的6種對(duì)羥基苯甲酸酯. 色譜，2009，27（6）：804-808.