高效液相色譜法測定不同加工方法白芍中芍藥苷的含量

張海先，劉海萍，曾銳

白芍是毛茛科植物芍藥Paeonia lactiflora Pall．的干燥根，夏、秋兩季采挖，洗凈后除去頭尾及細(xì)根，置沸水中煮后除去外皮或去外皮后再煮，曬干?？唷⑺?，微寒，具有平肝止痛，斂陰止汗等功效[1~3]。芍藥苷是白芍的主要有效成分，具有降低血壓、護(hù)肝、鎮(zhèn)痛等作用[2~3]。四川中江和安微亳州歷來為白芍的道地產(chǎn)區(qū)。《藥物出產(chǎn)辯》（1931）中記載：“白芍產(chǎn)四川中江、渠縣為川芍，產(chǎn)安徽亳州為亳芍?！?目前大量文獻(xiàn)報(bào)道市售白芍商品中芍藥苷含量多低于藥典規(guī)定[4~9]；另有研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)地加工方法的不同對芍藥苷含量的影響比較大，從而直接影響白芍的質(zhì)量[3,10]。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法測定川芍和亳芍中芍藥苷的含量，比較白芍鮮藥、陰干、水煮后去皮曬干樣品的內(nèi)在質(zhì)量，為建立白芍最佳產(chǎn)地加工方法提供一定的參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

Waters 2695高效液相色譜系統(tǒng)，配四元梯度泵，真空脫氣機(jī)，自動進(jìn)樣器，Waters 2996型PAD檢測器，Empower色譜工作站； KQ5200E型超聲波清洗器（功率200 W，頻率40 kHz，昆山市超聲儀器有限公司）；METTLER AE240型電子分析天平（中國瑞士梅特勒公司）。芍藥苷對照品購自中國藥品生物制品檢定所（批號：110736-200934，純度95.7%）；乙腈 (色譜純)，甲醇(色譜純)，樂百氏純凈水（過0.45 μm濾膜），其他試劑均為分析純。

本實(shí)驗(yàn)用新鮮和水煮后去皮曬干的白芍藥材分別收集于四川中江縣逢春制藥白芍GAP種植基地和安徽亳州白芍藥材種植基地；因四川中江大量陰干白芍出口日本，故同時收集四川中江陰干白芍藥材進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；白芍藥材的生長年限均為 4年。經(jīng)西南民族大學(xué)民族醫(yī)藥研究院劉圓教授鑒定為毛茛科植物芍藥Paeonia lactif l ora Pall．的根。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Diamonsil C18柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)；流動相為乙腈-0.1%磷酸(14:86)；檢測波長230 nm；柱溫 30 ℃；流速 1 mL·min-1；進(jìn)樣量10 μL，規(guī)定理論塔板數(shù)按芍藥苷峰計(jì)算不低于2000。高效液相色譜圖見圖1。

圖1 白芍對照品和供試品HPLC圖

2.2 對照品溶液的制備

取芍藥苷對照品2.9 mg，精密稱定后置25 mL量瓶中，用甲醇溶液溶解并定容至刻度，搖勻后備用。

2.3 供試品溶液的制備

取白芍藥材中粉約0.1 g，精密稱定后置于50 mL量瓶中，加入稀乙醇35 mL溶解，稱定質(zhì)量后超聲處理（功率240 W，頻率45 kHz）30 min，放冷后稀乙醇補(bǔ)足重量，定容，搖勻并用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 取上述芍藥苷對照品溶液，分別進(jìn)樣5 μL，15 μL，18 μL，20 μL，25 μL測定峰面積，以含量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性范圍為0.555μg ~2.78μg，得回歸方程為 Y = 7×10-7X - 0.0045，相關(guān)系數(shù)r =0.9998。

2.4.2 精密度試驗(yàn) 取“2.2”項(xiàng)下的芍藥苷對照品溶液（0.111 mg·mL-1）10 μL，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，測定芍藥苷峰面積積分值，RSD為0.99%，說明進(jìn)樣精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一芍藥供試品溶液（川白芍鮮藥），配制后室溫放置，在0，4，8，12，24，48 h注入高效液相色譜儀，依法測定峰面積， RSD 為1.03%，表明本實(shí)驗(yàn)芍藥供試品在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一白芍樣品（川白芍鮮藥）6份，每份0.05 g，按“2.3”項(xiàng)制備供試品溶液，在上述色譜條件下分別測定芍藥苷的含量，RSD為0.92%，表明重復(fù)性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取已知芍藥苷含量的白芍樣品（川白芍鮮藥）6份，每份0.05 g，分別精密加入芍藥苷對照品溶液，各進(jìn)樣10 μL測定峰面積，計(jì)算加樣回收率，平均回收率為97.15%；RSD為1.53%，表明本方法準(zhǔn)確度較好。

2.5 樣品含量測定

將5份白芍樣品按“2.3”項(xiàng)制備，取10 μL供試品溶液注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定，記錄色譜圖并用外標(biāo)法計(jì)算各樣品芍藥苷含量，數(shù)據(jù)分析采用SPSS19.0 軟件進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)（LSD法），結(jié)果見表 1。

表1 不同產(chǎn)地加工方法白芍藥材芍藥苷含量測定結(jié)果（n=3）

3 討論

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，四川中江：鮮藥＞陰干＞水煮后去皮曬干，鮮藥和陰干法對水煮后去皮曬干法具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；安徽亳州：鮮藥＞水煮后去皮曬干，鮮藥對水煮后去皮曬干法具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分析原因可能是由于芍藥苷易溶于水，水煮過程極易造成芍藥苷流失[3]；白芍藥材除主要含有芍藥苷外，還有芍藥內(nèi)酯苷、沒食子酸、苯甲酸、兒茶素等成分[11~13]，有作者認(rèn)為這與中藥自身成分的復(fù)雜性有關(guān)，不同來源的樣品中化學(xué)成分的比例不同[14]，不同加工方法是否造成白芍中化學(xué)成分比例的改變，需進(jìn)行多成分同時含量測定并結(jié)合藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步深入探討。

水煮后去皮曬干的白芍藥材，川白芍含量明顯大于亳白芍，筆者在藥材基地實(shí)地考察過程中發(fā)現(xiàn)亳州當(dāng)?shù)剞r(nóng)戶加工白芍時，水煮時間比較隨意且較長，是造成芍藥苷較大損失的主因，建議應(yīng)當(dāng)對白芍的產(chǎn)地加工進(jìn)行規(guī)范以保證白芍藥材質(zhì)量。本研究為制訂白芍藥材規(guī)范的產(chǎn)地加工方法提供參考。

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