應(yīng)用EST－ILPs分子標(biāo)記技術(shù)快速鑒定菟絲子屬種子

郭瓊霞， 莊 蓉，2， 黃 振， 黃可輝，2＊

（1.福建出入境檢驗(yàn)檢疫局，福州 350001；2.福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，福州 350002）

近年來，分子標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于遺傳圖譜構(gòu)建、基因克隆、基因定位、遺傳多樣性分析、基因組比較、標(biāo)記輔助育種等方面的研究［1－3］。由于EST來源于編碼區(qū)，內(nèi)含子位置通常較為保守；而不同種或地理亞種間的內(nèi)含子長(zhǎng)度又存在差異，故用它建立的ILPs分子標(biāo)記在種間鑒定上具有優(yōu)越性。采用ILPs（intron length polymorphisms）分子標(biāo)記在菟絲子屬的分類鑒定上國(guó)內(nèi)外均未見報(bào)道。因此本研究利用旋花科（Convolvulaceae）番薯屬（Ipomoea）的EST（expressed sequence tags，Tags，表達(dá)序列標(biāo)簽）序列，通過網(wǎng)站（http：∥ibi.zju.edu.cn／pgl／pip／index.html）查找內(nèi)含子和外顯子，然后根據(jù)網(wǎng)站自動(dòng)設(shè)計(jì)的引物，再對(duì)9個(gè)菟絲子的樣品進(jìn)行引物的篩選，尋找種間特異性條帶從而達(dá)到分類鑒定的目的。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本試驗(yàn)選用菟絲子屬（Cuscuta）5個(gè)近似種（含不同的地理型）的種子作為研究材料。各個(gè)種的種子材料來源詳見表1。

表1 材料來源

1.2 總DNA的提取與凝膠電泳檢測(cè)

1.2.1 菟絲子總DNA的提取

選取菟絲子的種子為材料，采用SDS法提取總 DNA［4］。

1.2.2 凝膠電泳檢測(cè)

采用高必達(dá)等［5］設(shè)計(jì)的一對(duì)能檢測(cè)ITS序列的特異 性 引 物：A1（5′－TCGTAACAAGGTTTCCGTAG－3′）與 A2（5′－AGGAGGCCAGGATCTATT－3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為：25μL（10×PCR buffer，25mmol／L MgCl2，10mmol／L dNTP，5 U／μL Taq DNA 聚合酶，10μmol／L 引物，模板DNA約為100ng／μL）。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃5min；94℃1min，55℃1min，72℃1min，35個(gè)循環(huán)；72℃7min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖電泳分離，檢測(cè)400～500bp左右的擴(kuò)增片段。從而根據(jù)電泳圖上此擴(kuò)增片段的有無判斷是否提取出DNA。

1.3 ILPs標(biāo)記的獲得和ILPs－PCR

ILPs標(biāo)記是由浙江大學(xué)汪旭升、趙向前等根據(jù)已公布全基因組序列開發(fā)的一種內(nèi)含子長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記［6］。從網(wǎng)站（http：∥ibi.zju.edu.cn／pgl／pip／index.html）上公布的ILPs標(biāo)記中選擇引物。選取旋花科番薯屬已經(jīng)設(shè)計(jì)好的引物10對(duì)（如表2所示），對(duì)菟絲子樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，進(jìn)而選擇特異性片段。

ILPs－PCR反應(yīng)體系總體積為20μL，其中含100ng模 板 DNA；上、下 游 引 物 各 0.5μmol／L；200μmol／L dNTP；1.5mmoL／L MgCl2；1UTaq DNA聚合酶；2μL 10×PCR反應(yīng)緩沖液。PCR擴(kuò)增程序：94℃ 5min；94 ℃ 46s，52.5 ℃ 45s，72 ℃1min，35個(gè)循環(huán)；72℃10min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖電泳分離。對(duì)于擴(kuò)增產(chǎn)物非特異性條帶多的引物進(jìn)一步優(yōu)化起始退火溫度，調(diào)整范圍為50～58℃。每對(duì)引物組合至少重復(fù)2次以確保擴(kuò)增結(jié)果的可靠性。擴(kuò)增產(chǎn)物上樣于6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠，320V電泳1h45min。參照許紹斌等［7］的方法進(jìn)行銀染。

表2 試驗(yàn)所用的引物

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA凝膠電泳的檢測(cè)

試驗(yàn)結(jié)果表明，采用SDS法提取菟絲子屬5個(gè)近似種（含不同的地理型）種子的總DNA，經(jīng)過凝膠電泳，其顯示在400～500bp得到一條明亮的特異條帶（如圖1所示）。從而證明所提取的菟絲子種子DNA有效，最后將已提取的DNA保存于－20℃?zhèn)溆谩?/p>

圖1 利用引物A1和A2的rDNA－ITS PCR擴(kuò)增圖譜

2.2 聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)

因?yàn)橥嘶饻囟仁怯绊慞CR擴(kuò)增結(jié)果的重要因素，所以對(duì)試驗(yàn)條件進(jìn)行調(diào)整與優(yōu)化，經(jīng)試驗(yàn)得出結(jié)果：退火溫度為52.5℃可獲得滿意的分型效果。因此設(shè)定PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃5min；94℃46s，52.5℃45s，72℃1min，35個(gè)循環(huán)；72℃10min；于4℃保存。

根據(jù)引物IP9－1和IP9－2的聚丙烯酰胺凝膠電泳所檢測(cè)的結(jié)果（如圖2）所示，不同種的菟絲子呈現(xiàn)多態(tài)性的帶型。

圖2 IP9－1和IP9－2引物在材料1～9中的擴(kuò)增產(chǎn)物（6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳）

利用引物IP9－1和IP9－2擴(kuò)增的試驗(yàn)結(jié)果顯示：菟絲子屬5個(gè)近似種（含不同的地理型）9個(gè)種子樣品之間的內(nèi)含子長(zhǎng)度表現(xiàn)為5種基因型AB、A、ABC、BD、ABD。三明日本菟絲子與苜蓿菟絲子內(nèi)含子長(zhǎng)度的基因型均為AB；霞浦日本菟絲子內(nèi)含子長(zhǎng)度基因型為A；恩氏菟絲子內(nèi)含子長(zhǎng)度的基因型為ABC；南方菟絲子內(nèi)含子長(zhǎng)度基因型為BD；福州馬尾、霞浦、福州鼓樓、新疆這4個(gè)地理型的田野菟絲子內(nèi)含子長(zhǎng)度的基因型都是ABD。從圖2可以看出恩氏菟絲子在250bp左右具有一條特異性條帶，使其可以與其他的菟絲子區(qū)分開。南方菟絲子與田野菟絲子在內(nèi)含子長(zhǎng)度的基因型上也具有差異；因此可以通過內(nèi)含子基因型的條帶多態(tài)性將田野菟絲子與南方菟絲子區(qū)分開。

用引物IP4－1和IP4－2擴(kuò)增的結(jié)果（如圖3）顯示，菟絲子屬9個(gè)樣品之間的內(nèi)含子表現(xiàn)為4種基因型EFG、EF、EG、E。三明日本菟絲子內(nèi)含子長(zhǎng)度的基因型為EFG；霞浦日本菟絲子內(nèi)含子長(zhǎng)度基因型為EF；恩氏菟絲子內(nèi)含子長(zhǎng)度基因型為EG；南方菟絲子、田野菟絲子、苜蓿菟絲子擴(kuò)增結(jié)果相同，基因型均為E。從圖3可以得出以下結(jié)果：兩種地理型的日本菟絲子在240bp左右具有一條特征條帶，使其可以與其他種的菟絲子區(qū)分開；苜蓿菟絲子與日本菟絲子在內(nèi)含子基因型上具有差異，可以通過條帶多態(tài)性將兩者區(qū)分開。從圖3還可以看出，不同地理型的日本菟絲子在基因型上也有所不同，三明日本菟絲子在175bp處有一條帶，但是霞浦日本菟絲子在175bp處卻沒有此條帶。

圖3 IP4－1和IP4－2引物在材料1～9中的擴(kuò)增產(chǎn)物（6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳）

通過圖4、圖5電泳結(jié)果的多態(tài)性綜合分析可以將本試驗(yàn)所選取的菟絲子5個(gè)近似種逐一鑒別開。

2.3 聚類分析以及分子系統(tǒng)樹

根據(jù)選擇的10對(duì)引物（如表2）擴(kuò)增出的穩(wěn)定條帶，利用平均連鎖聚類方式（UPGMA）軟件進(jìn)行聚類分析，生成9個(gè)供試材料的親緣關(guān)系樹狀圖（如圖6）。

圖6 根據(jù)菟絲子近似種的ILPs分子標(biāo)記構(gòu)建的種間親緣關(guān)系圖

從圖6可以看出：田野菟絲子、苜蓿菟絲子、南方菟絲子的親緣關(guān)系比較接近；這3種與日本菟絲子、恩氏菟絲子之間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

3 討論

本研究對(duì)菟絲子的5個(gè)近似種的內(nèi)含子長(zhǎng)度多態(tài)性進(jìn)行了ILPs－PCR分析。從本試驗(yàn)結(jié)果看出，a條帶可作為恩氏菟絲子的特異性條帶（如圖2示）；d條帶可作為日本菟絲子特異性條帶（如圖3示）。利用ILPs分子標(biāo)記檢測(cè)菟絲子近似種是菟絲子種間鑒定的新途徑。隨著ILPs分子標(biāo)記檢測(cè)的深入研究與發(fā)展，該技術(shù)將為我國(guó)口岸雜草檢疫鑒定提供一種快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，同時(shí)也為雜草檢疫科學(xué)理論的發(fā)展奠定良好的基礎(chǔ)。

通過本研究結(jié)果可知，不同地理型的日本菟絲子在內(nèi)含子多態(tài)性的基因型上具有差異。因此可對(duì)不同地理區(qū)域的同種菟絲子進(jìn)行進(jìn)一步的比較研究，從而完善菟絲子分類鑒定的依據(jù)。還可以進(jìn)一步從網(wǎng)站（http：∥ibi.zju.edu.cn／pgl／pip／index.html）上公布的ILPs標(biāo)記中選擇引物進(jìn)行篩選，進(jìn)而選擇菟絲子種間特異性片段，完善并實(shí)現(xiàn)菟絲子種間的快速檢驗(yàn)檢測(cè)。

［1］ 吳海濱，朱汝財(cái)，李迪.一個(gè)內(nèi)含子長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記與栽培稻F1花粉育性基因座連鎖［J］.分子植物育種，2006，4（3）：323－328.

［2］ 曾華宗，鄭成木，朱穩(wěn)，等.甘蔗種質(zhì)間親緣關(guān)系及特異標(biāo)記的RAPD分析［J］.植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2003，4（2）：99－100.

［3］ 盧泳全，汪旭升，黃偉素，等.基于水稻內(nèi)含子長(zhǎng)度多態(tài)性開發(fā)禾本科擴(kuò)增共有序列遺傳標(biāo)記［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，39（3）：433－439.

［4］ 王得元，鄧義才，李乃堅(jiān).RAPD標(biāo)記檢測(cè)蔬菜種子純度中DNA提取方法研究［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，1999（3）：13－14.

［5］ 高必達(dá)，程毅，朱水芳，等.基于ITS序列的菟絲子PCR鑒定［J］.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2006，32（4）：368－370.

［6］ 汪旭升，趙向前，盧泳全，等.一種新型的分子標(biāo)記：內(nèi)含子長(zhǎng)度多態(tài)性［C］∥2005植物分子育種國(guó)際學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集，2005.

［7］ 許紹斌，陶玉芬，楊昭慶，等.簡(jiǎn)單快速的DNA銀染和膠保存方法［J］.遺傳，2002，24（3）：335－336.