早期大劑量納洛酮對(duì)彌漫性軸索損傷患者β淀粉樣前體蛋白的影響

白洪濤，尹 勇，苗雨露，趙 萬(wàn)

（廣東省深圳市龍崗區(qū)第二人民醫(yī)院神經(jīng)外科 518112）

彌漫性軸索損傷（Diffuse axonal injury，DAI）是一種頭部在加速運(yùn)動(dòng)時(shí)腦深部組織因剪應(yīng)力作用引起的原發(fā)性閉合性顱腦損傷，一直以來(lái)無(wú)特效的救治措施［1］。納洛酮作為一種人工合成的非特異性阿片受體拮抗劑，在顱腦損傷后早期應(yīng)用可抑制阿片受體的激活，從而產(chǎn)生降低顱內(nèi)壓、減輕腦水腫、改善腦代謝及意識(shí)障礙的作用。但其治療顱腦損傷的用量、療程仍存在爭(zhēng)議［2］。β淀粉樣前體蛋白（β－APP）是一種具有受體樣結(jié)構(gòu)的大分子跨膜糖蛋白，由高爾基體產(chǎn)生并由軸突的快軸漿運(yùn)輸通道運(yùn)輸［3－4］。有研究表明，DAI后不久神經(jīng)元β－APP的表達(dá)即上調(diào)，檢測(cè)DAI后血漿β－APP的濃度可作為判斷DAI損傷嚴(yán)重程度及治療有效與否的可靠指標(biāo)［1］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察早期大劑量納洛酮治療后DAI患者β－APP濃度的變化，以期為大劑量納洛酮用于臨床治療DAI的安全性及有效性提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2007年6月至2011年3月在本院經(jīng)臨床檢查診斷為DAI的56例患者納入本研究。其中，男33例，女23例；年齡20～62歲，平均（33.32±10.26）歲。因交通肇事致傷者31例，高處墜落致傷者13例，打擊致傷者5例，手術(shù)致者7例。參照文獻(xiàn)［5］確立本組患者的納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）頭部遭受加速性旋轉(zhuǎn)外力作用；（2）創(chuàng)傷后昏迷，但受傷后至入院時(shí)間小于6 h；（3）CT掃描和（或）MRI檢查證實(shí)大腦皮質(zhì)和髓質(zhì)交界處、神經(jīng)核團(tuán)和白質(zhì)交界處、胼胝體、腦干有單發(fā)或多發(fā)直徑小于2cm的無(wú)占位效應(yīng)出血灶及腦室內(nèi)出血、腦彌漫性腫脹、蛛網(wǎng)膜下腔出血，中線結(jié)構(gòu)無(wú)明顯移位；（4）無(wú)明確定位神經(jīng)體征。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）患有高血壓病、糖尿病、肝腎功能不全等嚴(yán)重慢性疾病者；（2）嚴(yán)重的多發(fā)傷和（或）復(fù)合傷者；（3）已使用其他類似藥物或?qū){洛酮代謝造成影響的藥物者；（4）入院時(shí)已雙瞳孔散大、眼球固定、無(wú)自主呼吸者。56例患者中，伴發(fā)腦挫裂傷者14例，伴發(fā)顱內(nèi)血腫者8例，伴發(fā)腦室內(nèi)出血者5例。格拉斯哥昏迷評(píng)分（GCS）3～5分者31例，6～8分者25例，平均5.84分。根據(jù)患者同等傷情隨機(jī)分為對(duì)照組、小劑量治療組及大劑量治療組，分別為18、19、19例。3組患者年齡（F＝0.037，P＝0.963）、性別（χ2＝2.144，P＝3.142）、GCS評(píng)分（F＝0.654，P＝0.526）、致傷原因（χ2＝0.70，P＝0.15）等臨床指標(biāo)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。

1.2 治療方法 取得所有患者家屬的知情同意后，對(duì)照組常規(guī)給予保持呼吸道通暢、循環(huán)支持、降顱壓、防治血管痙攣、維持內(nèi)環(huán)境平衡等治療。小劑量、大劑量治療組在對(duì)照組的常規(guī)治療基礎(chǔ)上，分別按0.1、0.4mg·kg－1·d－1的劑量給予納洛酮治療，加入生理鹽水250mL另管靜脈滴注，維持24h；3d后將劑量調(diào)整為4.8mg／d，加入生理鹽水250mL另管靜脈滴注，維持24h；共治療10d。治療前及治療后1、3、7d，采集患者晨起空腹靜脈血2mL于乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管中，輕輕搖勻以充分抗凝，分離血漿，－20℃冰箱保存待測(cè)。參照文獻(xiàn)［6］的方法制作十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠（SDSPAGE）。在微量離心管中，用2倍SDS加樣緩沖液1∶1稀釋待測(cè)血清樣品，100℃煮沸5min。100V恒壓下電泳至溴酚藍(lán)前沿到達(dá)分離膠，將電壓調(diào)整至200V，繼續(xù)電泳至預(yù)染蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)所示目的分子質(zhì)量出現(xiàn)為止。用轉(zhuǎn)移緩沖液沖洗凝膠，并浸泡30min進(jìn)行平衡。剪一塊凝膠大小的硝酸纖維素（NC）濾膜標(biāo)記正反面，轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡15min.將纖維墊片、濾紙、NC濾膜及凝膠置入含有冷卻裝置的轉(zhuǎn)移槽中。注入4℃轉(zhuǎn)移緩沖液，100V電轉(zhuǎn)移60min。后取出NC濾膜，TBS緩沖液沖洗后置入3%的牛血清清蛋白（BSA）中，室溫下振動(dòng)60min；將NC濾膜置于抗APP一抗孵育，室溫下振動(dòng)60 min；用TTBS沖洗NC濾膜6次，每次室溫振動(dòng)5min；將NC濾膜置于辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗中孵育，室溫下振動(dòng)60min；用TIBS沖洗6次，每次振動(dòng)5min；將化學(xué)發(fā)光底物（ECL）A、B液等體積混合；NC濾膜浸潤(rùn)在混合液中5min；將NC濾膜在暗室中置X線感光膠片上曝光30s，將感光膠片放入顯影劑中5min，清水沖洗2次，放入定影劑中10min，清洗，晾干。圖像分析采用Tiger凝膠圖像分析儀進(jìn)行。采用Western blot檢測(cè)3組患者血漿β－APP的平均吸光度值，以此表示β－APP表達(dá)。治療后1、3、7d，采用GCS評(píng)分系統(tǒng)對(duì)患者進(jìn)行評(píng)分；同時(shí)，在治療過(guò)程中觀察并記錄皮疹、肝腎功能損害、躁狂、精神障礙等與過(guò)量應(yīng)用納洛酮的藥物不良反應(yīng)，評(píng)估藥物的安全性。

表1 對(duì)照組、小劑量及大劑量治療組患者一般情況比較（±s）

表1 對(duì)照組、小劑量及大劑量治療組患者一般情況比較（±s）

組別 n 年齡（歲） 性別（男／女） GCS評(píng)分（分） 致傷原因（n）車禍 高處墜落 打擊 手術(shù)對(duì)照組 18 31.36±8.96 11／7 5.71±2.30 10 4 2 2小劑量治療組 19 32.00±9.89 10／9 5.80±2.44 10 5 2 2大劑量治療組 19 33.12±10.68 12／7 5.75±2.27 11 4 1 3

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，所有數(shù)據(jù)均以±s表示，組間比較采用單因素方差分析和非參統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不良反應(yīng)結(jié)果 治療期間，小劑量及大劑量治療組均未發(fā)生皮疹、肝腎功能損害、躁狂、精神障礙等與過(guò)量應(yīng)用納洛酮相關(guān)的不良反應(yīng)。

2.2 GCS評(píng)分比較 治療后1、3d，對(duì)照組、小劑量及大劑量治療組之間GCS評(píng)分比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；治療后7d，對(duì)照組、小劑量及大劑量治療組之間GCS評(píng)分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 治療后不同時(shí)間對(duì)照組、小劑量及大劑量治療組患者GCS評(píng)分比較（分，±s）

表2 治療后不同時(shí)間對(duì)照組、小劑量及大劑量治療組患者GCS評(píng)分比較（分，±s）

時(shí)間 對(duì)照組（n＝19）小劑量治療組（n＝19）大劑量治療組（n＝19）F P治療后1d 5.72±2.01 5.79±2.40 6.01±2.30 0.832 0.540治療后3d 5.88±2.36 5.93±2.62 6.42±2.55 0.746 0.925治療后7d 6.38±2.87 6.98±3.11 8.85±3.23 0.612 0.010

表3 治療后不同時(shí)間對(duì)照組、小劑量及大劑量治療組患者血清β－APP含量比較（ng／mL，±s）

表3 治療后不同時(shí)間對(duì)照組、小劑量及大劑量治療組患者血清β－APP含量比較（ng／mL，±s）

時(shí)間 對(duì)照組（n＝19）小劑量治療組（n＝19）大劑量治療組（n＝19）F P治療前 130.64±64.96 114.01±58.64 113.27±62.32 0.690 0.320治療后1d100.10±52.21 111.26±50.48 112.03±57.84 0.570 0.612治療后3d90.34±50.26 79.93±48.33 63.12±47.61 1.820 0.012治療后7d71.20±30.16 65.75±25.20 44.38±23.27 1.4600.000

2.3 β－APP含量比較 治療前及治療后1d，對(duì)照組、小劑量及大劑量治療組患者血清中β－APP含量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；治療后3、7d，對(duì)照組、小劑量及大劑量治療組患者血清中β－APP含量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表3。治療后1、3、7d，對(duì)照組、小劑量及大劑量治療組患者血清中β－APP含量較治療前差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討 論

DAI由于頭部在外力作用下瞬間的旋轉(zhuǎn)使腦在慣性驅(qū)使下作非線性加－減速運(yùn)動(dòng)，產(chǎn)生一種與旋轉(zhuǎn)軸相垂直的剪切力；剪切力作用于神經(jīng)纖維致軸索損傷，作用于腦實(shí)質(zhì)血管致腦組織內(nèi)點(diǎn)狀出血［5］。以傷后數(shù)小時(shí)至數(shù)天出現(xiàn)軸突腫脹和軸突回縮球?yàn)橹饕±韺W(xué)特征［6］。正常腦組織中β－APP主要存在于多囊結(jié)構(gòu)、核膜、高爾基體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，由于其表達(dá)水平很低而不易被檢測(cè)［7］。在機(jī)械性損傷、缺血缺氧及興奮性毒素等病理因素作用下，β－APP可作為一種快速反應(yīng)性蛋白而誘導(dǎo)表達(dá)增高［8］。Sherriff等［9］研究發(fā)現(xiàn)，在腫脹的軸索中可見(jiàn)β－APP陽(yáng)性反應(yīng)，且頭部損傷后β－APP陽(yáng)性的軸索部位表現(xiàn)為DAI中所描述的軸索回縮球，提示軸索β－APP的免疫反應(yīng)性可能代表了軸突損傷。外傷性腦損傷導(dǎo)致的細(xì)胞骨架崩解、細(xì)胞軸漿流動(dòng)停止是β－APP在軸突積聚的一個(gè)重要原因，故而較多學(xué)者認(rèn)為β－APP是軸突損傷和斷裂很好的標(biāo)志物［10－11］。納洛酮作為阿片受體拮抗劑，可通過(guò)拮抗阿片受體而減輕β－APP所產(chǎn)生的病理效應(yīng)，保護(hù)腦組織［12］。但目前有關(guān)納洛酮治療DAI，對(duì)患者血清中β－APP的蛋白表達(dá)研究卻較為少見(jiàn)。為此，本研究納入了受傷后至入院時(shí)間小于6h的DAI患者，以期檢測(cè)早期大劑量納洛酮對(duì)DAI患者β－APP的影響作用。

本研究采用0.1、0.4mg·kg－1·d－1兩種劑量的納洛酮對(duì)患者進(jìn)行了治療，并應(yīng)用 Western blot檢測(cè)了對(duì)照組、小劑量及大劑量治療組患者血清中β－APP的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示，治療后3d大劑量治療組患者血清中β－APP的蛋白表達(dá)較其他兩組明顯降低。DAI后3～5d往往是腦水腫和繼發(fā)性神經(jīng)損害的高峰期，此時(shí)的β－APP含量能更準(zhǔn)確地反映患者的病情程度。本研究結(jié)果表明，納洛酮大劑量治療能更顯著的降低DAI患者腦水腫高峰期的β－APP含量，從而更有效地控制顱內(nèi)壓，減輕腦水腫，改善腦代謝。作者還發(fā)現(xiàn)，治療后7d大劑量治療組患者的GCS評(píng)分明顯高于其他兩組。說(shuō)明納洛酮能明顯改善DAI患者的臨床癥狀和預(yù)后。納洛酮治療顱腦損傷的機(jī)制，國(guó)內(nèi)外多有相關(guān)研究，現(xiàn)就本院的實(shí)驗(yàn)結(jié)果總結(jié)如下：（1）可競(jìng)爭(zhēng)性阻斷內(nèi)源性阿片受體與中樞和外周神經(jīng)的結(jié)合，抑制軟膜血管收縮，增加腦血流和腦灌注壓。緩解腦血管痙攣，改善腦組織的微循環(huán)和組織供氧，減少繼發(fā)性損害［13］。（2）抑制氧自由基的產(chǎn)生和抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用，穩(wěn)定細(xì)胞膜及溶酶體，減少溶酶釋放。（3）內(nèi)皮素是目前所知最強(qiáng)烈的血管收縮因子。顱腦損傷后，內(nèi)皮素水平明顯升高且與臨床癥狀加重相符，從而引起一系列反應(yīng)，損害神經(jīng)細(xì)胞［14］。而納洛酮的應(yīng)用可降低內(nèi)皮素水平，提高降鈣素基因相關(guān)肽水平，保護(hù)神經(jīng)元［15］。（4）解除內(nèi)源性阿片肽物質(zhì)對(duì)呼吸、心血管的抑制作用，抑制外周血管平滑肌收縮，提高心肌輸出量，調(diào)節(jié)血壓，改善循環(huán)，增加腦干血氧供應(yīng)，保護(hù)生命中樞。提示納洛酮治療腦外傷有一定的時(shí)間窗限制，越早用藥，其防止神經(jīng)細(xì)胞凋亡的效果越好。

綜上所述，早期大劑量應(yīng)用納洛酮治療彌漫性軸索損傷，可促進(jìn)患者神經(jīng)功能恢復(fù)及改善預(yù)后，同時(shí)無(wú)明顯藥物不良反應(yīng)發(fā)生，具有較好的安全性，值得臨床推廣應(yīng)用。但由于本研究樣本量較小，有關(guān)其更可靠的療效及禁忌證尚有待今后更大樣本量的研究加以探討。

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