316L醫(yī)用不銹鋼材料加載低濃度三氯生抑菌效果評(píng)價(jià)

余海亮，李可洲，劉恒全，黃 楠，蒲 克，駱 樂(lè)，姚豫桐

隨著影像技術(shù)及生物工程的發(fā)展，膽管內(nèi)支架植入逐漸成為治療膽道良、惡性狹窄非外科手術(shù)的主要方法，但支架植入后的膽道損傷、膽道反復(fù)感染、細(xì)菌生物膜形成、膽泥淤積、膽石形成、腫瘤生長(zhǎng)、組織反應(yīng)增生等［1-2］導(dǎo)致置入支架的膽管再次梗阻，這一直是膽道外科介入治療的難點(diǎn)，其中膽道感染對(duì)支架植入后膽道再梗阻的發(fā)生和發(fā)展呈正相關(guān)［3-4］，為了防止支架植入后膽道感染及膽道再狹窄，膽道支架中逐漸改良為藥物涂層支架。

本研究是觀察并評(píng)價(jià)三氯生在體外低濃度下及加載于膽道支架材料膽汁環(huán)境下的抑菌效果，及評(píng)價(jià)聯(lián)合紫杉醇后其抑菌效果，并與臨床常用藥物鹽酸左氧氟沙星相比較，現(xiàn)報(bào)告如下。

材料與方法

1 抑菌環(huán)實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)步驟按NCCLS M2-A7(2000年)紙片擴(kuò)散法［5］標(biāo)準(zhǔn)操作。三氯生-聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)-丙酮溶液配制:分別取三氯生0.01g和PLGA 0.02g溶解于99%的化學(xué)純丙酮溶液10ml中，三氯生藥物濃度為1mg/ml，再用倍比稀釋法進(jìn)行稀釋，分別配制成濃度為 A:1mg/ml，B:0.5mg/ml，C:0.25mg/ml，D:0.125mg/ml，E:0.0625mg/ml，F(xiàn):0.03125mg/ml的三氯生-PLGA-丙酮溶液;鹽酸左氧氟沙星溶液濃度相同;紫杉醇丙酮溶液濃度為0.01mg/ml。試驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)用SPSS 10.0軟件進(jìn)行方差分析，P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 藥物材料表面涂層體外膽汁浸泡實(shí)驗(yàn)

2.1 滅菌膽汁制備 取新鮮人“T”管引流膽汁100ml，將人膽汁用60Co放射性同位素γ射線輻照滅菌，劑量為8kGy。

2.2 三氯生涂層材料的制備 取316L醫(yī)用不銹鋼材料切割成直徑5mm，厚度為2mm的圓形小片，共計(jì)12片，再用依次用200目、400目、600目、800目、1000目、1200目砂紙及拋光布機(jī)械拋光材料致鏡面;將經(jīng)蒸餾水、超聲波震蕩洗滌后，高溫消毒，三氯生-PLGA-丙酮溶液(0.25mg/ml)旋轉(zhuǎn)噴涂于316L醫(yī)用不銹鋼材料表面，噴涂旋轉(zhuǎn)8周，置入真空環(huán)境中干燥1h。

2.3 方法 材料表面藥物涂層體外膽汁浸泡實(shí)驗(yàn) 取預(yù)先消毒的6×4孔平板，取消毒膽汁4ml分別注入孔內(nèi)，再滴入兩種配置好的菌懸液0.5ml，振蕩3min后分別加入制備好316L醫(yī)用不銹鋼裸材料(A組)、316L醫(yī)用不銹鋼+PLGA+三氯生(B組)的材料片，置入37℃振蕩溫箱培養(yǎng)24h后取出觀察結(jié)果。

2.4 藥物材料表面涂層體外膽汁浸泡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)用間接免疫熒光染色標(biāo)定層黏連蛋白及細(xì)菌，用BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)對(duì)各組切片單位面積陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比進(jìn)行半定量分析，并用掃描電鏡觀察、拍照浸泡后材料的表面超微結(jié)構(gòu)。所有步驟均嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)操作。

2.5 圖像處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 在100倍物鏡下用熒光顯微鏡拍照，對(duì)熒光數(shù)量進(jìn)行半定量分析。結(jié)果采用χ2檢驗(yàn)、秩和檢驗(yàn)，采用SPSS 10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 抑菌環(huán)法檢測(cè)結(jié)果

在測(cè)試的不同三氯生藥物濃度下對(duì)大腸桿菌和糞腸球菌的抑菌環(huán)均明顯，按規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)判定有抑菌作用(表1)。與相同濃度的左氧氟沙星藥物相比較，均優(yōu)于同濃度的左氧氟沙星(P＜0.005);但聯(lián)合紫杉醇后，三氯生抑菌效果相對(duì)單用三氯生明顯降低(P＜0.005)，與左氧氟沙星比較也無(wú)明顯優(yōu)勢(shì)(P＞0.005)。

2 免疫熒光染色結(jié)果

如圖1、2所示，三氯生-PLGA涂層的316L醫(yī)用不銹鋼材料表面吸附的細(xì)菌為8.52%，而316L醫(yī)用不銹鋼裸材料表面吸附細(xì)菌69.48%，兩者相比有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，而如圖3、4所示，三氯生-PLGA涂層的材料表面吸附的層黏連蛋白為75.54%，相比之下裸材料表面的為89.81%，兩者之間也有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。

3 掃描電鏡檢測(cè)結(jié)果

掃描電鏡可見(jiàn)316L醫(yī)用不銹鋼裸材料表面有較多球菌及桿菌呈團(tuán)塊樣黏附，而三氯生-PLGA表面黏附明顯減少(圖5、6)。

表1 各試驗(yàn)樣片的平均抑菌環(huán)直徑(mm±s)

表1 各試驗(yàn)樣片的平均抑菌環(huán)直徑(mm±s)

兩種陰性對(duì)照抑菌環(huán)直徑為0mm。試驗(yàn)用各菌懸液的平均濃度:大腸桿菌:108 7000CFU/ml;糞腸球菌:14304000CFU/ml。與相同濃度的左氧氟沙星藥物相比較:*P＜0.005

濃度 三氯生組 左氧氟沙星組 三氯生+紫杉醇組大腸桿菌 糞腸球菌A 40.23±1.54* 38.55±1.83* 28.75±1.28 30.54±1.87 29.54±1.54 22.64±1.38大腸桿菌 糞腸球菌 大腸桿菌 糞腸球菌12.27±1.83 14.67±1.88 12.86±1.31 7.84±1.87 B 35.44±1.85* 36.64±1.32* 23.63±2.13 28.46±1.75 26.64±1.28 17.39±1.45 C 31.65±1.78* 32.86±1.52* 19.04±1.38 24.53±1.52 19.76±1.25 15.24±1.28 D 27.75±1.18* 28.27±2.18* 17.45±1.76 21.63±1.28 17.86±1.48 11.49±1.83 E 24.26±2.05* 23.69±1.86* 13.93±1.39 17.42±1.86 14.67±1.27 9.48±1.35 F 21.85±1.28* 22.06±1.88*

圖1 三氯生-PLGA涂層表面黏附細(xì)菌的熒光標(biāo)定( ×100)

圖2 316L醫(yī)用不銹鋼材料裸材料表面黏附細(xì)菌的熒光標(biāo)定( ×100)

圖3 三氯生-PLGA涂層表面吸附層黏連蛋白的熒光標(biāo)定( ×100)

圖4 316L醫(yī)用不銹鋼裸材料表面吸附層黏連蛋白熒光標(biāo)定( ×100)

圖5 三氯生-PLGA表面黏附細(xì)菌掃描電鏡( ×3000)

圖6 316L醫(yī)用不銹鋼裸材料表面黏附細(xì)菌掃描電鏡( ×3000)

討 論

在支架置入早期，膽道感染就是加重患者原有膽道梗阻及膽管炎癥狀的根本原因，是導(dǎo)致支架置入后膽道再次阻塞的主要原因。

Neve等［6］報(bào)道了膽道梗阻后膽道中最常見(jiàn)的微生物是大腸桿菌(36.6%)，肺炎克雷伯菌(18.3%)，銅綠假單胞菌(8.3%)，普通變形桿菌(8.3%)和凝固酶陰性葡萄球菌(8.3%)。Rerknimitr和 Fogel［7］對(duì)支架植入病人膽汁進(jìn)行培養(yǎng)，并與無(wú)支架病員的膽汁進(jìn)行比較:其中支架置入組的陽(yáng)性率(98%)明顯高于無(wú)支架組(55%)，且易于出現(xiàn)菌血癥(46%vs 21%，P＜0.05)，其中最常見(jiàn)的細(xì)菌為糞腸球菌(31%)，而無(wú)支架組膽道梗阻感染中最常見(jiàn)的細(xì)菌為大腸埃希桿菌(17%)。

支架植入后，在這些植入物的表面快速的覆蓋了1層宿主分泌的吸附蛋白，形成1層20～100A的蛋白吸附層，如纖維連接蛋白、層黏連蛋白、纖維素、膠原和免疫球蛋白［8］;纖維連接蛋白和玻璃黏連蛋白(S-蛋白)被認(rèn)為是吸附在支架內(nèi)表面主要的膽汁蛋白［9］;以這些物質(zhì)表面為條件，使隨之進(jìn)入膽道的細(xì)菌很容易黏附在材料表面。細(xì)菌表面的一些結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，如莢膜、鞭毛、菌毛和黏液在細(xì)菌的黏附中起著關(guān)鍵的作用;纖維蛋白、玻璃黏連蛋白和黏蛋白可促進(jìn)細(xì)菌黏附于支架表面的過(guò)程，特別是細(xì)菌配體一旦遇到能與之結(jié)合的生物材料或吸附在材料表面上蛋白層中的受體上，則牢固地黏附在生物材料表面，完成黏附過(guò)程中受體與配體的結(jié)合，使黏附進(jìn)一步加固，逐漸形成細(xì)菌生物膜，從而避免被人體吞噬細(xì)胞及大劑量抗生素的殺滅［10］;糞腸球菌和厭氧的產(chǎn)氣莢膜桿菌、梭狀芽孢桿菌產(chǎn)生一種葡萄糖醛酸苷酶，分解膽紅素加速膽汁沉渣的形成;同時(shí)細(xì)菌的磷脂酶C能水解膽汁中的卵磷脂，引起脂肪酸鈣鹽的沉積，從而導(dǎo)致了大量的不溶于水的物質(zhì)形成并在膽管中沉淀，阻塞膽管［11］。

三氯生化學(xué)名稱 2，4，4’-三氯-2’-羥基二苯醚，易溶于多種有機(jī)溶劑及表面活性劑，但對(duì)強(qiáng)酸強(qiáng)堿及熱具有高度穩(wěn)定性，且對(duì)常見(jiàn)致病性革蘭氏陽(yáng)性陰性細(xì)菌、真菌、酵母及病毒等都具有廣泛的殺滅及抑制作用，從而日漸廣泛應(yīng)用于醫(yī)療衛(wèi)生領(lǐng)域;但在內(nèi)置導(dǎo)管、支架方面沒(méi)有相關(guān)研究。三氯生主要通過(guò)抑制細(xì)菌脂肪酸合成系統(tǒng)中的一個(gè)關(guān)鍵酶-烯脂酰-?；d體蛋白還原酶(ENR)的活性，阻止細(xì)菌合成脂肪酸［12］，從而抑制細(xì)菌細(xì)胞膜的形成和細(xì)菌的繁殖，由于人類沒(méi)有這個(gè)關(guān)鍵ENR酶，三氯生一直被認(rèn)為對(duì)人體影響較小;本試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)低濃度的三氯生對(duì)糞腸球菌和大腸桿菌均顯示出有明顯的抑菌效果;這兩種細(xì)菌是膽道常見(jiàn)的致病菌，且分別代表了革蘭氏陽(yáng)性球菌、革蘭氏陰性桿菌，說(shuō)明該藥物在體外對(duì)常見(jiàn)細(xì)菌繁殖體具有較好的抗菌應(yīng)用價(jià)值，且呈劑量依賴性，隨著劑量的降低，抑菌環(huán)逐漸減小;但與臨床常用于膽道系統(tǒng)抗生素鹽酸左氧氟沙星相比較，同等濃度下三氯生明顯優(yōu)于左氧氟沙星抗菌效果，但在紫杉醇應(yīng)用后，不同濃度下的三氯生抗菌效果均有所減弱，考慮為三氯生羥基鍵與紫杉醇形成化學(xué)鍵結(jié)合，影響了三氯生與細(xì)菌酶的結(jié)合，從而影響了抗菌效果。在膽汁浸泡環(huán)境下，三氯生的抗菌效果仍較為明顯，但材料表面的蛋白黏附仍較多，說(shuō)明三氯生僅有抗菌效果，通過(guò)抑制細(xì)菌繁殖、減少黏附，使得膽汁中蛋白成分吸附于三氯生涂層的材料表面有所減少;但在體內(nèi)膽道情況下三氯生效果需進(jìn)一步研究，且課題組將進(jìn)一步選用聯(lián)合協(xié)同抗蛋白黏附的藥物，延長(zhǎng)膽道支架置入后通暢時(shí)間，逐步進(jìn)行安全性實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，以進(jìn)一步減輕疾病癥狀、延長(zhǎng)膽道再次梗阻時(shí)間。

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