狂犬病基因工程滅活疫苗（Hep－Flury－d G株）的免疫效力＊

施赫赫，宋偉科，黃永亮，劉祥茵，代元元，傅秋玲，張 瑩，林穎儀，陽佑天，徐曉娟，王怡飛，郭霄峰

狂犬?。≧abies）又叫恐水癥，病原為彈狀病毒科（Rhabdoviridae）狂犬病病毒屬（Lyssavir us）中的成員。此病可傳播于哺乳動物、鳥類和人，為人獸共患?。?］，在全球100多個國家和地區(qū)均有發(fā)生，99%的人間狂犬病來自病犬。人感染后一旦出現(xiàn)臨床癥狀，幾乎100%死亡。據(jù)世界衛(wèi)生組織公布的數(shù)據(jù)，每年約有5．5萬人死于狂犬病，并且絕大多數(shù)死亡發(fā)生在非洲和亞洲的農(nóng)村地區(qū)［2］。我國近年的年報(bào)告狂犬病死亡人數(shù)僅次于印度，居全球第二位，一直位于我國各類法定報(bào)告?zhèn)魅静∷劳鋈藬?shù)的前三位［3］。廣東省衛(wèi)生廳公布的全省法定報(bào)告?zhèn)魅静∫咔橹校?010年全年狂犬病報(bào)告死亡數(shù)居乙類病第二位［4］；2011年1～5月，居第二和第三位［5－9］?？袢∫殉蔀槲覈顬閲?yán)重的公共衛(wèi)生問題之一。

狂犬病病毒基因組長約12 kb，結(jié)構(gòu)基因從5′－3’端依次為N、P、M、G和L，分別編碼核蛋白、磷蛋白、基質(zhì)蛋白、糖蛋白和轉(zhuǎn)錄酶大蛋白。其中由G基因編碼的糖蛋白，是病毒與宿主細(xì)胞結(jié)合的配體，介導(dǎo)了病毒與靶細(xì)胞的結(jié)合及在神經(jīng)系統(tǒng)的分布，不但與病毒的毒力、致病性密切相關(guān)，而且是狂犬病毒的主要保護(hù)性抗原，能刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，保護(hù)機(jī)體抵抗病毒的感染。當(dāng)前無論是人用狂犬病疫苗還是獸用疫苗的效價(jià)主要取決于疫苗制劑中糖蛋白的含量［10］。

為了預(yù)防農(nóng)村地區(qū)犬狂犬病的傳播和減少狂犬病由犬傳給人的機(jī)率，研究長效、安全、低廉的獸用狂犬病滅活疫苗具有重大公共衛(wèi)生意義。目前，國內(nèi)使用的獸用狂犬病疫苗為滅活苗和減毒活疫苗。滅活苗均為進(jìn)口疫苗，安全性高，但價(jià)格昂貴，適用于經(jīng)濟(jì)條件好的城市地區(qū)，對于經(jīng)濟(jì)落后的農(nóng)村地區(qū)，大規(guī)模接種進(jìn)口滅活苗是不現(xiàn)實(shí)的。國內(nèi)生產(chǎn)上市的獸用疫苗，迄今為止仍為減毒活疫苗，雖然價(jià)格低廉，適用性廣泛，但具有一定的返祖風(fēng)險(xiǎn)，安全性明顯不及滅活苗。世界衛(wèi)生組織已經(jīng)明確提出應(yīng)當(dāng)盡快停止家養(yǎng)動物繼續(xù)使用減毒活疫苗。本實(shí)驗(yàn)室通過反向遺傳技術(shù)獲得一株致病性更弱、免疫原性更強(qiáng)、繁殖率更高的重組狂犬病病毒（HEP－Flury－d G），將該病毒與ESSAL GEL佐劑混合，制成疫苗可誘導(dǎo)犬只產(chǎn)生高水平的抗體［11］，被免疫的犬只在180 d內(nèi)抗體陽性率保持在100%，抗體滴度高于0．6 EU／m L的比格犬均能抵御致死性強(qiáng)毒的攻擊［12］。

本試驗(yàn)通過擴(kuò)大試驗(yàn)，進(jìn)一步證實(shí)該疫苗在臨床狀態(tài)下的免疫效力，為疫苗的推廣應(yīng)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料與試劑

1．1．1 免疫對象 廣州市增城區(qū)某村家養(yǎng)犬只。在施用基因工程滅活疫苗前，部分犬只已于2010年4月和10月（即當(dāng)?shù)孬F醫(yī)站進(jìn)行的狂犬病春防與秋防期間）注射過狂犬病弱毒疫苗（Fl ury株），抗體水平≥0．6 EU／m L僅有17只，陽轉(zhuǎn)率為43．58%。

1．1．2疫苗 獸用狂犬病基因工程滅活疫苗（Hep－Fl ur y－d G株）：由華南農(nóng)大生物藥品有限公司生產(chǎn)的中試產(chǎn)品。

1．1．3 掃描儀器與芯片 RF－ID高容量型低頻手持機(jī)，型號為SMC－H134 U；動物芯片注射器，型號為HIGH ML。

1．1．4 檢測試劑 狂犬病犬源標(biāo)準(zhǔn)血清由OIE指定的法國Nancy狂犬病參考實(shí)驗(yàn)室提供，批號為Batch 2010－1，每支8 IU／m L，狂犬病抗體 ELISA檢測試劑盒為法國SYNBIOTICS公司產(chǎn)品，注冊號為EUROPE 69007－LYON，用于檢測抗狂犬病病毒的抗體。本試劑盒檢測結(jié)果以一種與國際標(biāo)準(zhǔn)抗血清相當(dāng)?shù)膯挝槐硎?，即（EU／m L），當(dāng)抗體滴度＞0．6EU／m L，該動物被認(rèn)為是具有抗狂犬病病毒保護(hù)力的。

1．2 方法

1．2．1 犬只的免疫 隨機(jī)選取66只3月齡以上的犬只，免疫前每犬頸部皮下植入一顆基因芯片，以高容量型低頻手持閱讀機(jī)讀取每犬的芯片編碼。詳細(xì)記錄畜主姓名、住址、犬只性別、年齡、毛色。然后每只犬皮下免疫注射1 m L基因工程滅活疫苗。

1．2．2 狂犬病抗體檢測 疫苗免疫前第0 d和免疫后第21 d分別采集犬只的血樣，分離血清。以間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測狂犬病抗體。依據(jù)《陸生動物診斷和疫苗手冊》，被檢血清的抗體滴度高于0．6 EU／m L時，認(rèn)為動物是疫苗免疫后的血清陽轉(zhuǎn)，具有有效的抗體水平［13］。孫招金［11］和頓燦［12］等的研究結(jié)果表明，當(dāng)小鼠和犬產(chǎn)生高于0．6 EU／m L的抗狂犬病病毒抗體時，小鼠和犬能免受狂犬病病毒野毒株的感染，存活率達(dá)100%；被檢比格犬產(chǎn)生高于0．6 EU／m L的抗狂犬病病毒抗體時，該犬對強(qiáng)毒的攻擊具有保護(hù)力。

1．2．3 統(tǒng)計(jì)分析 使用SPSS Statistics分析軟件和 Microsoft 2003 Excel的 數(shù) 據(jù) 分 析 程 序［20－21］。t檢驗(yàn)用于免疫前后抗體水平的比較，單因素方差分析用于不同性別和年齡間抗體變化的比較。

2 結(jié) 果

2．1 免疫前后犬只的抗體水平 免疫前，隨機(jī)抽取66只犬，采集血樣，注射芯片跟蹤監(jiān)測。免疫后21 d獲得對應(yīng)66只犬的血樣。以ELISA方法檢測兩批血清樣品的抗狂犬病病毒抗體水平。結(jié)果表明，基因工程滅活疫苗免疫前抗體水平≥0．6 EU／m L的犬只為17只，陽轉(zhuǎn)率為26%。免疫后21 d抗體水平≥0．6 EU／m L的犬只為55只，總陽轉(zhuǎn)率為83%（表1、2）。

2．2 免疫前后抗體水平的比較 為了驗(yàn)證免疫前后抗體水平的差異性，對66只犬的抗體滴度進(jìn)行t檢驗(yàn)。結(jié)果表明，P＜0．05，即免疫前后抗體水平有顯著性差異（表3）。

2．3 性別、年齡對抗體水平的影響 為了檢驗(yàn)不同性別和年齡的犬只免疫后抗體水平的差異，將抗體檢測結(jié)果分為公犬組、母犬組、幼犬組（年齡18個月以下）和成犬組，進(jìn)行性別和年齡的方差分析。結(jié)果表明，性別分組的P＞0．05（P＝0．41），無顯著性差異，即性別不影響抗體水平的變化（見表4）。但是，以年齡分組的P＜0．05（P＝0．000009），有顯著性差異，即性別影響免疫后的抗體水平變化（表5）。

表1 犬只免疫前后抗體水平Tab．1 Antibody levels of dogs before and after i mmunization

表2 犬只免疫前后抗體陽轉(zhuǎn)率Tab．2 Antibody positive conversion rates of dogs before and after immunization

表3 免疫前后抗體水平統(tǒng)計(jì)Tab．3 Antibody level before and after immunization

表4 免疫后公犬和母犬抗體水平變化統(tǒng)計(jì)Tab．4 Antibody level in male／female dogs before and after i mmunization

表5 免疫后幼犬和成犬抗體水平變化統(tǒng)計(jì)Tab．5 Antibody level in young／adult dogs before and after i mmunization

3 討 論

為了獲取基因工程滅活疫苗（HEP－Fl ury－d G株）在臨床條件下對犬只的免疫效力，本試驗(yàn)對廣州市增城區(qū)某村家養(yǎng)犬只進(jìn)行了免疫注射。結(jié)果顯示，免疫后21 d隨機(jī)采集的66份血樣中55份抗體效價(jià)≥0．6 EU／m L，總抗體陽轉(zhuǎn)率達(dá)到83%。其中，免疫基因工程疫苗前抗體水平低于≤0．6 EU／m L的犬只49只，免疫后≥0．6 EU／m L的犬只38只，抗體陽轉(zhuǎn)率為77．6%。另外，免疫前抗體水平≥0．6 EU／m L的17只犬，以基因工程滅活疫苗免疫后，抗體水平大大提高。表明該滅活疫苗已達(dá)臨床應(yīng)用的要求［13］。

分析采集的66份血清背景信息，其中39份樣品的犬只（年齡均大于8個月）曾于5個月前免疫注射過狂犬病弱毒疫苗（Fl ur y株），抗體水平≥0．6 EU／m L僅有17只，陽轉(zhuǎn)率為43．58%，離犬群間形成堅(jiān)強(qiáng)免疫帶的70%尚有一定距離，表明現(xiàn)在使用的弱毒疫苗其免疫效果確實(shí)值得商榷。66份血清樣品中，3月齡以上犬只抗體水平＜0．6 EU／m L為40只，以基因工程滅活疫苗對它們進(jìn)行免疫后，33只的抗體水平≥0．6 EU／m L，陽轉(zhuǎn)率為82．5%，說明該疫苗免疫犬只可產(chǎn)生足夠保護(hù)力，可有效降低狂犬病的傳播［12，14］。在我們的另一個實(shí)驗(yàn)中，15只雜種犬飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室，以基因工程滅活疫苗免疫后，抗體陽性率保持在100%，而且抗體水平一直維持在較高水平［12］，表明田間飼養(yǎng)的犬只與實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)的犬只對該疫苗的反應(yīng)性稍有差異。

分析不同性別、不同年齡的犬只對該疫苗的免疫反應(yīng)。試驗(yàn)結(jié)果顯示，公犬和母犬的平均抗體水平分別為3．83 EU／m L和4．80 EU／m L，P＞0．05，表明犬只的性別對該疫苗的免疫效果沒有影響。而幼犬和成年犬的平均抗體水平為2．11和7．44，P＜0．05，有顯著性差異，揭示年齡因素對該疫苗的誘導(dǎo)時的抗體水平有一定的影響，但不影響只犬的抗體陽轉(zhuǎn)。

［1］Bai WB，Yu KZ．Diagnostics of infectious diseases in animals［M］．Beijing：China Agricult ure Press．2002：1．（in Chinese）白文彬，于康震．動物傳染病診斷學(xué)［M］．北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2002：1

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