姜黃素衍生物的合成及其抗腫瘤活性

魏 冬， 姜 波， 薛 璇， 汪佳鳳， 周雙生

（現(xiàn)代中藥安徽省工程技術(shù)中心，安徽中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，安徽 合肥 230031）

姜黃素（Curcumin）是從姜黃屬中藥姜黃、郁金、莪術(shù)等塊莖中提取出來(lái)的一種天然產(chǎn)物，為二酮類(lèi)化合物。姜黃具有破血行氣、通經(jīng)止痛等功效，一直作為藥食兩用的藥材；此外，還用于治療胸肋刺痛、閉經(jīng)風(fēng)濕肩臂疼痛及咽喉腫痛等。

多年研究表明，姜黃素具有廣泛的藥理作用，如抗氧化、抗凝、抗人類(lèi)免疫缺陷病毒、抗菌、抗腫瘤、抗突變等［1］。近期研究還顯示，姜黃素的抑瘤作用機(jī)制主要與誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)，它是通過(guò)調(diào)控抑癌基因、癌基因及其蛋白的表達(dá)、誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯［2］及調(diào)控細(xì)胞凋亡信號(hào)等途徑實(shí)現(xiàn)，除此之外，姜黃素還可能通過(guò)抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、影響激素水平等機(jī)制達(dá)到抗腫瘤的目的［3］，因其低毒、低分子量、抗腫瘤作用廣泛，曾被認(rèn)為是理想的抗癌化學(xué)治療藥物之一。然而姜黃素在體內(nèi)的溶解性小、體內(nèi)吸收少、代謝過(guò)快，生物利用度低，極大地限制了它的應(yīng)用。劉劍敏等人［4］將姜黃素結(jié)構(gòu)修飾，使酚羥基改造成了N—馬來(lái)?！被嵋唤S素單酯及乙酰姜黃素等衍生物，改善了脂溶性并增強(qiáng)了姜黃素在體內(nèi)的活性。Ohtsu H等［5］將姜黃素的酚羥基甲基化得到的衍生物具有強(qiáng)烈的抗雄激素活性，能夠用于前列腺癌的臨床治療，其效果要優(yōu)于臨床上使用的羥基氟他胺，而姜黃素本身沒(méi)有這種活性。為了更好的探索姜黃素類(lèi)化合物的抗腫瘤活性，本文制備了兩種新型姜黃素衍生物。并評(píng)價(jià)了它們與生物大分子對(duì)接能力及其抗腫瘤活性。目標(biāo)化合物合成路線如Scheme 1：

Scheme 1：目標(biāo)化合物的合成路線

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與主要儀器

姜黃素，溴乙烷，芐基氯，購(gòu)至國(guó)藥基團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，均為分析純。人乳腺癌細(xì)胞MCF－7（中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù)）。培養(yǎng)基：RPMI－1640培養(yǎng)粉（美國(guó)GIBCO公司），用三蒸水配制，添加10%小牛血清，無(wú)菌過(guò)濾，4℃?zhèn)溆?。MTT（3－（4，5－二甲基噻唑－2）－2，5－二苯基四氮唑溴鹽，又稱為噻唑藍(lán)，美國(guó)sigma公司）；TriPure試劑盒。

WRS－1B數(shù)字熔點(diǎn)儀（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；Nicolet Avatar 370DTGS 型紅外光譜儀（美國(guó)）；Bruker 400MHz超導(dǎo)核磁共振儀（德國(guó)）；TSQ Quantum Access MAX三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀（美國(guó)）。

1.2 姜黃素衍生物的合成

（1）二乙基姜黃素的合成（B）

將1g姜黃素（A）溶解在20ml N，N－二甲基甲酰胺中，隨后投入1.2g碳酸鈉固體，80℃下回流反應(yīng)15min后加入5ml溴乙烷，隨后繼續(xù)反應(yīng)3h（TLC跟蹤），反應(yīng)完成后加入100ml水溶解鈉鹽，用乙酸乙酯萃取混合液三次，合并有機(jī)層，用1mol／L氫氧化鈉溶液洗滌有機(jī)層數(shù)次，再水洗數(shù)次后加入無(wú)水硫酸鎂，蒸干有機(jī)層可得固體。此固體用硅膠柱分離，V（石油醚）：V（乙酸乙酯）＝8：1為洗脫劑，收集產(chǎn)物，得橙黃色固體0.43g，產(chǎn)率為37.3%，m.p：141－142℃；IR （KBr）υ ：2927（CH3），1627（C＝O），1513（C＝C），1588，1468，1419（Ar），1261 （＝CH），804，711（CH）；1H－NMR（CDCl3，400MHz）δ：1.47 （t，6H，J＝8Hz，CH3），3.93（s，6H，－OCH3），4.12（q，4H，J＝8Hz，CH2），5.81（s，2H，CH2），6.51 （d，2H，J＝16Hz，＝CH），7.08－7.13（m，6H，Ar－H），7.62（d，2H，J＝16Hz，＝CH－Ar）；MS（ESI）m／z：424。

（2）三芐基姜黃素的合成（C）

化合物C的合成方法與B類(lèi)似，用芐基氯替代了溴乙烷。得到的固體用硅膠柱分離，V（石油醚）：V（乙酸乙酯）＝10：1為洗脫劑，收集產(chǎn)物。得淡黃色固體0.47g，產(chǎn)率為33.2%，m.p：157－159℃；IR（KBr）：2931（CH3），1634（CO），1521（C＝C），1596，1501，1435（Ar），1269（＝CH），953，856，812（CH）；1H－NMR（CDCl3，400MHz）δ：3.96（s，6H，CH3），3.85（s，4H，－OCH2），5.16 （s，1H，CH2），6.53 （d，2H，J＝16Hz，＝CH），6.79－7.40（m，15H，Ar＇－H），7.35（m，6H，Ar－H），7.67 （d，2H，J＝16Hz，＝CHAr）；MS（ESI）m／z：628。

1.3 分子對(duì)接

分子對(duì)接［5，6］是藥物發(fā)現(xiàn)研究中的關(guān)鍵步驟，也是最直觀了解生物大分子與藥物小分子相互作用的手段。人類(lèi)乙二醛酶是癌癥細(xì)胞主要排毒通道中重要的功能性蛋白，是公認(rèn)的有效抑制癌癥的作用靶點(diǎn)之一。我們運(yùn)用 MOE（Molecular Operating Environment）軟件［7］模擬了目標(biāo)化合物分子與人類(lèi)乙二醛酶中1Q1N蛋白［8］的對(duì)接情況，并計(jì)算出它們各自的結(jié)合作用能力。

1.4 抗腫瘤活性

將MCF－7細(xì)胞接種于75ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，與37℃、5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3天傳代1次。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞消化、以4.0×104／孔的密度接種于96孔板，培養(yǎng)24h后，分別加入含藥物的培養(yǎng)液100μl繼續(xù)培養(yǎng)24h。按藥物濃度2.5，5.0，10.0，20.0，40.0，80.0μmol／L分為6組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。對(duì)照組以培養(yǎng)液取代，也設(shè)6個(gè)復(fù)孔。在時(shí)間結(jié)束前4h，每孔加MTT 20μl，培養(yǎng)技術(shù)后，吸棄上清液，每孔加入DMSO 150μl，振動(dòng)10min，用酶標(biāo)儀570nm處測(cè)定每孔D值。計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率如下：

2 結(jié)果與討論

2.1 姜黃素衍生物的結(jié)構(gòu)確認(rèn)

2.1.1 乙基姜黃素（B）的結(jié)構(gòu)

由核磁氫譜中數(shù)據(jù)可知，7.62ppm處的雙重峰位于連接苯環(huán)雙鍵H的化學(xué)位移，7.08－7.13ppm區(qū)間出現(xiàn)的多重峰屬于苯環(huán)的H的化學(xué)位移，6.51 ppm處的雙峰為非連苯環(huán)的雙鍵H的化學(xué)位移，4.70ppm附近的單峰峰屬于連在兩個(gè)羰基間的亞甲基H的化學(xué)位移，在4.12ppm處出現(xiàn)的四重峰屬于氧乙基中亞甲基H的化學(xué)位移，3.93ppm出現(xiàn)的單峰歸屬于甲氧基的H的化學(xué)位移。同時(shí)根據(jù)紅外光譜的數(shù)據(jù)1627cm－1處有一強(qiáng)共軛羰基吸收峰，1513cm－1是碳碳雙鍵吸收峰，1588，1468，1419cm－1處則為苯環(huán)骨架吸收峰。質(zhì)譜中明顯存在目標(biāo)化合物m／z的分子離子峰，表明該物質(zhì)分子在常溫下較穩(wěn)定。綜合上述數(shù)據(jù)可知，該化合物即為實(shí)驗(yàn)要合成的目標(biāo)化合物B。

2.1.2 芐基姜黃素（C）的結(jié)構(gòu)

根據(jù)核磁氫譜中數(shù)據(jù)可知，7.67ppm處的雙重峰位于連接苯環(huán)雙鍵 H的化學(xué)位移，7.40～7.35 ppm區(qū)間出現(xiàn)的多重峰屬于姜黃素苯環(huán)的H的化學(xué)位移，7.19－6.79ppm區(qū)間出現(xiàn)的多重峰則屬于芐基苯環(huán)的H的化學(xué)位移，6.53ppm處的雙峰為非連苯環(huán)的雙鍵H的化學(xué)位移，5.16ppm處的單峰峰屬于連在兩個(gè)羰基間的亞甲基H的化學(xué)位移，在4.22ppm處出現(xiàn)的四重峰屬于乙酸乙基中末端亞甲基H的化學(xué)位移，3.87ppm處的單峰歸屬于連接雙酮氧上芐基的乙基中H的化學(xué)位移，由于此處的氫峰的位置化學(xué)位移較低，如果芐基取代在雙酮之間碳上的活潑氫，此時(shí)芐基上的乙基的化學(xué)位移應(yīng)該較高，故推測(cè)芐基是接在雙酮氧上，而不是在其亞甲基位置，此外3.36ppm處的單峰歸屬于甲氧基中的甲基H的化學(xué)位移。同時(shí)根據(jù)紅外光譜的數(shù)據(jù)1634cm－1處有一強(qiáng)共軛羰基吸收峰，1521cm－1是 碳 碳 雙 鍵 吸 收 峰，1596，1501，1435 cm－1處則為苯環(huán)骨架吸收峰。質(zhì)譜中明顯存在目標(biāo)化合物m／z的分子離子峰，表明該物質(zhì)分子在常溫下較穩(wěn)定。綜合上述數(shù)據(jù)可知，該化合物即為實(shí)驗(yàn)要合成的目標(biāo)化合物C。

2.2 生物活性實(shí)驗(yàn)

以姜黃素為陽(yáng)性對(duì)照，采用經(jīng)典的MTT法對(duì)化合物B和C進(jìn)行了體外抗腫瘤活性測(cè)試，細(xì)胞株選用人乳腺癌細(xì)胞MCF－7，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1和圖1。

圖1 不同濃度的姜黃素及其衍生物對(duì)MCF－7細(xì)胞的抑制率（24h）

表1 不同化合物對(duì)MCF－7的IC50（24h）

從表1中數(shù)據(jù)可以看出，化合物B和C具有良好的抗腫瘤活性，其中化合物B，即二乙基姜黃素，對(duì)MCF－7的IC50值為19.23μM，優(yōu)于姜黃素（A）本身（IC50為38.65μM），這可能是由于姜黃素上氫被乙基取代帶后，增加了其脂溶性，使其生物利用度增加，從而使其活性增強(qiáng)，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致［4，5］；而化合物C，即三芐基姜黃素，其活性不及姜黃素，這可能是由于姜黃素分子中引入多芐基后，分子空間位阻增大，它與受體結(jié)合能力減弱，使其活性降低（IC50為57.31μM）。

一般情況下，受體與藥物分子之間作用力越強(qiáng)，其本身能量降的越低，形成的分子越穩(wěn)定，其生物活性越強(qiáng)。為了進(jìn)一步佐證目標(biāo)化合物的生物活性，我們應(yīng)用了MOE評(píng)價(jià)了藥物與靶點(diǎn)分子對(duì)接，即以目標(biāo)物分子與乙二醛酶1Q1N蛋白分子發(fā)生對(duì)接結(jié)合作用，實(shí)驗(yàn)情況見(jiàn)圖2～圖4。

圖2 姜黃素（A）與1Q1N蛋白空間結(jié)合圖及能量表（Kcal／mol）

圖3 二乙基姜黃素（B）與1Q1N蛋白空間結(jié)合圖及能量表（Kcal／mol）

圖4 芐基姜黃素（C）與1Q1N蛋白空間結(jié)合圖及能量表（Kcal／mol）

其實(shí)驗(yàn)結(jié)果與數(shù)據(jù)顯示，化合物與靶點(diǎn)蛋白結(jié)合能降低值大小順序?yàn)椋築（二乙基姜黃素，－41.94 KJ／mol）、A（姜黃素，－38.51KJ／mol）、C（三芐基姜黃素，－32.78KJ／mol），明上述化合物與受體作用效果：B物最強(qiáng)，C物最弱，這與上述 MTT法體外測(cè)試抗腫瘤活性結(jié)果相一致。

［1］趙心宇，孟秀香，賈莉等.姜黃素抗腫瘤機(jī)制［J］.實(shí)用藥物與臨床，2006，9（1）：51－52.

［2］Park MJ，Kim EH，Park IC，et al.Curcumin inhibit，cell cycle progression of immortalized human umbilreal vein endothelial（ECV304）cells by up－regulation cyclin－dependent kinase inhibitor，p21WAF1／CIP1，p27KIP1and p53［J］.Int J.Oncol，2002，21（2）：379－383.

［3］許東暉，王勝，金晶等.姜黃素的藥理作用研究進(jìn)展［J］.中草藥，2005，11（36）：1737－1740.

［4］劉劍敏，姜風(fēng)超.抗腫瘤前藥一姜黃素衍生物的設(shè)計(jì)合成及初步活性測(cè)試［J］.中國(guó)藥師，2005，8（7）：543－545.

［5］Ohtsu H，Xiao ZhiYan，Ishida J，et a1.Antitumor agents 217 curcumin analogues as novel androgen receptor antagonists with potential as antiprostate cancer agents［J］.J Med Chem，2002，45（23）：5037－5042.

［6］周家駒，王亭.藥物設(shè)計(jì)中的分子模型化方法［M］.北京：科學(xué)出版社，2001：56－64.

［7］楊華崢.農(nóng)藥分子設(shè)計(jì)［M］.北京：科學(xué)出版社，2003：145－167.

［8］喬園園，郭盛.分子模擬軟件MOE及其在藥物中的應(yīng)用示例［J］.計(jì)算機(jī)與應(yīng)用化學(xué)，2005，22（2）：157－160.

［9］Minggui Yuan，Minxian Luo，Yao Song，et al.Identification of curcunmin derivatives as human glyxalase I inhibitors：A combination of biological evaluation molecular docking，3D－QASR and molecular dynamics simulation studies［J］，Bioorganci＆Medicinal Chemistry，2011，19：1189－1196.