陜北棗ISSR反應(yīng)體系的建立及其優(yōu)化

王延峰，史妮妮，李永鑫，葉 飛，賀曉龍，陳國(guó)梁

（1.延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西 延安 716000；2.陜西省區(qū)域生物資源保育與利用工程技術(shù)研究中心，陜西 延安 716000）

中國(guó)是棗類遺傳變異和起源較早的中心地區(qū)之一。棗也是陜北地區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)植物之一，隨著西部大開發(fā)以及退耕還林的實(shí)施，棗業(yè)經(jīng)濟(jì)得到迅猛發(fā)展，在陜北黃河沿岸諸縣脫貧致富中發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。由于棗樹的單胚性特點(diǎn)，在復(fù)雜的生態(tài)環(huán)境下，形成了極其豐富的遺傳多樣性，這也就導(dǎo)致了至今為止人們對(duì)于該種質(zhì)資源的演化關(guān)系及其種間關(guān)系不甚清楚，給棗的優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源的保護(hù)帶來(lái)了不便。前人對(duì)棗品種的分類從形態(tài)學(xué)、細(xì)胞核型分析、同工酶生化標(biāo)記等方面做了大量的研究[1]，但都因其工作過(guò)程繁瑣、費(fèi)時(shí)，以及受敏感的生態(tài)環(huán)境和其有限的標(biāo)記數(shù)量與因素的影響，使棗樹的遺傳多樣性研究一直受到限制，這也就使得人們將研究的方向轉(zhuǎn)到了分子生物學(xué)方面。近幾年，相繼出現(xiàn)了許多DNA 分子標(biāo)記技術(shù)，如SSR（simple sequence repeats，簡(jiǎn)單重復(fù)序列）、簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性（inter-simple sequence repeats，ISSR）、RFLP （restriction fragment length polymorphism，限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性）、AFLP（amplified fragment length polymorphism 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性）、RAPD（random amplified polymorphic DNA，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA）等[2-3]。其中ISSR（inter simple sequence repeat）標(biāo)記是基于微衛(wèi)星序列發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)技術(shù)[4]，它是根據(jù)植物廣泛存在簡(jiǎn)單重復(fù)序列的特點(diǎn)，并利用在植物基因組中常常出現(xiàn)的簡(jiǎn)單重復(fù)序列本身設(shè)計(jì)引物，無(wú)需預(yù)先克隆和測(cè)序。ISSR 標(biāo)記通常為顯性標(biāo)記，呈孟德爾式遺傳，具有很好的穩(wěn)定性和多態(tài)性，已在果樹遺傳學(xué)如品種鑒定、親緣關(guān)系分析、遺傳多樣性分析以及遺傳圖譜的構(gòu)建等方面得到廣泛應(yīng)用[5-12]。為了更好地對(duì)陜北棗類種質(zhì)資源收集保存、分類鑒定，筆者選用陜北地區(qū)的11 種棗樹品種，對(duì)最適ISSR-PCR 反應(yīng)體系的建立進(jìn)行了研究，以期為利用ISSR 標(biāo)記技術(shù)分析各品種間的親緣關(guān)系奠定實(shí)驗(yàn)技術(shù)基礎(chǔ)，為陜北棗品種的合理開發(fā)利用與選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

以陜北地方品種棗樹葉片為材料，供試品種有11 個(gè)，其中駿棗、脆棗、大團(tuán)棗、棗梨棗、木棗、灰條棗、贊皇大棗、狗頭棗、葫蘆棗采自延川縣，團(tuán)圓棗采自清澗縣，晉棗采自佳縣。采樣時(shí)均采取幼葉，用冰盒保存后立即帶回實(shí)驗(yàn)室，洗凈、晾干后于－70℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

所用引物參照劉興菊等[7]篩選出的10 條引物，由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。Taq DNA聚合酶及dNTP 購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 基因組DNA 的提取 采用改良CTAB 方法進(jìn)行棗葉片的基因組DNA 提取。獲得的DNA 經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)合格后，將樣品濃度調(diào)至50 ng/μL 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 ISSR 體系的優(yōu)化 PCR 基本反應(yīng)體系：1×PCR buffer，12.9 μL Easy PCR ystem，0.3 μmol/L 引物，1.5 U Taq DNA 聚合酶，DNA 模板50 ng。PCR反應(yīng)的優(yōu)化包括反應(yīng)體系各成分的含量和退火溫度的優(yōu)化。以狗頭棗的DNA 為模板，選用引物S46（序列為（CA）8G），其中引物濃度設(shè)0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 μmol/L 5 個(gè)濃度梯度；酶用量設(shè)0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 U 5 個(gè)梯度；退火溫度設(shè)置在46～60℃范圍內(nèi)，梯度溫度由美國(guó)THERMO 梯度PCR 儀自動(dòng)生成，采取3 次重復(fù)。

1.2.3 11 個(gè)棗樹品種間DNA 擴(kuò)增 采用優(yōu)化的ISSR 體系（25 μL）：1×PCR buffer，12.9 μL Easy PCR ystem，0.4 μmol/L 引物S46，DNA 模板50 ng，1.5 U TaqDNA 聚合酶，以及優(yōu)化后的PCR 程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性50 s，54.8℃退火50 s，72℃延伸5 min，共35 個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。在美國(guó)THERMO 梯度PCR 儀上進(jìn)行擴(kuò)增，然后取PCR 產(chǎn)物5 μL 進(jìn)行點(diǎn)樣，1.0%的瓊脂糖（EB）凝膠電泳，在UVP 凝膠成像系統(tǒng)下成像保存。以Tiangenr MarkerⅢ產(chǎn)生的帶為標(biāo)準(zhǔn)參照。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR體系的優(yōu)化

2.1.1 引物對(duì)PCR 擴(kuò)增的影響 從圖1 可以看出，在0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 μmol/L 引物濃度下，都能擴(kuò)增出目標(biāo)條帶。隨著引物濃度的升高，擴(kuò)增條帶由弱到強(qiáng)，帶型彌散程度逐漸減輕，非特異性擴(kuò)增條帶逐漸減少。引物濃度為0.1～0.3 μmol/L 時(shí)得到的PCR 產(chǎn)物主帶弱，非特異性擴(kuò)增條帶較多。當(dāng)引物濃度為0.4～0.5 μmol/L 時(shí)，PCR 反應(yīng)穩(wěn)定，條帶清晰，非特異性擴(kuò)增條帶少?？紤]節(jié)約試劑，試驗(yàn)合適的引物濃度為0.4 μmol/L。

圖1 不同引物濃度擴(kuò)增的ISSR 帶型

2.1.2 Taq 酶濃度對(duì)PCR 擴(kuò)增的影響 結(jié)果如圖2 所示，25 μL 反應(yīng)體系中Taq 酶用量為0.25 U 和0.5 U 時(shí)，帶型較模糊甚至某些條帶也會(huì)不出現(xiàn)；Taq 酶用量為1.0 U 時(shí)，條帶亮度較大，但出現(xiàn)了較多非特異性條帶或拖帶現(xiàn)象；Taq 酶用量>1.0 U時(shí)，目標(biāo)條帶帶型和強(qiáng)度較好。這說(shuō)明在一定范圍內(nèi)，隨著酶量的微量增加，目標(biāo)條帶亮度隨之增加。因此，在保證試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的前提下，考慮節(jié)省試劑，建議Taq 酶用量為1.5 U 。

圖2 不同Taq 酶濃度擴(kuò)增的ISSR 帶型

2.1.3 退火溫度對(duì)PCR 擴(kuò)增的影響 以駿棗棗樹幼葉為材料，退火溫度設(shè)定為12 個(gè)梯度，分別是46.1、46.5、47.4、48.6、50.2、52.1、54.8、56.7、58.4、59.8、60.9、61.3℃。經(jīng)過(guò)電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)隨著退火溫度的提高，條帶逐漸清晰增多。為了使電泳圖譜更加有對(duì)比度，從擴(kuò)增的12 個(gè)梯度中選用了7 個(gè)梯度（61.3、60.9、58.4、56.7、54.8、52.1、48.6℃）進(jìn)行電泳，結(jié)果如圖3 所示，當(dāng)退火溫度<54.8℃時(shí)，條帶弱少；當(dāng)退火溫度>54.8℃時(shí)，主條帶減弱，非特異性條帶增多，且拖帶趨于嚴(yán)重。不同引物的退火溫度有一定的差異，這與其堿基組成不同有直接的關(guān)系。有的引物在退火溫度為43℃時(shí)，便能擴(kuò)增出產(chǎn)物，而有的引物退火溫度達(dá)到55℃。由此看來(lái)，引物不同其退火溫度的上下限度有所不同，只有在一定溫度范圍內(nèi)提高退火溫度才可以增加擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，但溫度升高到一定值時(shí)，條帶便減弱、減少。試驗(yàn)結(jié)果顯示，退火溫度為52.1、54.8、56.7℃時(shí)，擴(kuò)增特異性表現(xiàn)較好，相比而言退火溫度為54.8℃時(shí)，主帶清晰而副帶少且無(wú)彌散，因此，引物S46 最適合的退火溫度為54.8℃。

圖3 不同退火溫度下的ISSR 帶型

2.2 棗樹品種的擴(kuò)增結(jié)果

利用優(yōu)化后的ISSR 反應(yīng)體系和程序篩選出的引物序列S46（退火溫度為54.8℃）重現(xiàn)性好、多態(tài)性明顯，對(duì)11 種棗樹幼葉的模板DNA 進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖4。擴(kuò)增電泳圖譜表明，11 種不同品種的條帶為4～7 條，主帶有2～3 條，次帶有2～4 條。依據(jù)主要條帶可以把所研究的棗樹品種分為3 類：駿棗、葫蘆棗、灰條棗歸為一類；脆棗、大團(tuán)棗、團(tuán)圓棗、梨棗，贊皇大棗歸為一類；木棗、狗頭棗、晉棗歸為一類。目前市場(chǎng)上很暢銷的狗頭棗在約1 300 bp處有一特異性條帶，可以和其他種類分開。

圖4 11 種棗樹品種特異引物擴(kuò)增

3 討 論

從ISSR 的擴(kuò)增結(jié)果來(lái)看，基于PCR 的ISSR 分子標(biāo)記技術(shù)受到多種因素的影響，尤其是TaqDNA聚合酶濃度、引物濃度及退火溫度。Taq 酶濃度和質(zhì)量對(duì)PCR 擴(kuò)增結(jié)果相當(dāng)重要[21]。Taq 酶濃度太低，會(huì)導(dǎo)致無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物或產(chǎn)物量相當(dāng)少；濃度過(guò)高不僅會(huì)造成經(jīng)濟(jì)上的浪費(fèi)，而且還會(huì)出現(xiàn)非特異性條帶，導(dǎo)致假陽(yáng)性，甚至有時(shí)候還會(huì)出現(xiàn)一整條通帶[13]。引物濃度對(duì)PCR 的帶型產(chǎn)生也有明顯的影響，過(guò)低或過(guò)高濃度的引物都不能產(chǎn)生很好的擴(kuò)增效果，這是由于引物濃度過(guò)低不能產(chǎn)生或只有極少量的擴(kuò)增產(chǎn)物，而引物濃度過(guò)高會(huì)增加引物二聚體的形成，引起模板與引物錯(cuò)配導(dǎo)致條帶不清晰或產(chǎn)生新的特異性位點(diǎn)使反應(yīng)特異性下降[14]。退火溫度較高可以提高擴(kuò)增的特異性，但過(guò)高也會(huì)使得酶的活性較早的消失，造成假陰性；過(guò)低會(huì)出現(xiàn)非特異性條帶，造成假陽(yáng)性。筆者優(yōu)化的最適退火溫度為54.8℃，這與劉興菊等[7]，齊靖等[15]的研究結(jié)果不同，這可能是由于試驗(yàn)所用的材料品種差異造成的。

通過(guò)篩選的S46 引物，在優(yōu)化的反應(yīng)條件下，不同的品種中都能產(chǎn)生清晰、穩(wěn)定的特征帶譜。狗頭棗可以用特有條帶把它與其他10 種棗區(qū)分開來(lái)。ISSR 通常為顯性標(biāo)記，呈孟德爾式遺傳，從而表現(xiàn)出很好的多態(tài)性和穩(wěn)定性，它具有可靠性高，技術(shù)難度低，多態(tài)性明顯，試驗(yàn)可重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，與RAPD、RFLP、AFLP、SSR 等分子標(biāo)記方法相比，具有快捷、穩(wěn)定、成本低、DNA 用量少和安全性較高等優(yōu)勢(shì)[3]。從研究中可以看出，同一樣品、同一引物在相同的PCR 反應(yīng)條件下，擴(kuò)增結(jié)果完全一致，說(shuō)明ISSR 技術(shù)的重復(fù)性和穩(wěn)定性都很好。且瓊脂糖電泳檢測(cè)結(jié)果表明，ISSR 標(biāo)記具有操作簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，容易在短時(shí)間內(nèi)獲得大量的分子標(biāo)記。因此，ISSR 技術(shù)已經(jīng)受到了生物學(xué)者的高度重視，并在多種植物的遺傳研究中得到了應(yīng)用。伴隨著ISSR標(biāo)記技術(shù)的廣泛應(yīng)用，必將會(huì)極大地加快棗屬植物分子標(biāo)記領(lǐng)域的研究步伐，這將對(duì)棗種質(zhì)資源收集保存、分類鑒定、品種選育和合理的開發(fā)利用具有重要的意義。

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