鐵超負荷兔模型3.0T MRI定量肝鐵沉積可行性研究

龍莉玲，彭 鵬，黃仲奎，李春燕，趙凡玉，龍 梅，李文美

地中海貧血是世界上最常見的單基因遺傳性疾病，在中國南方高發(fā)，其中廣西壯族地區(qū)最高，發(fā)病率約17.97%[1]。患者由于腸道過多的鐵吸收及接受長期反復輸血治療，不可避免的遭受鐵沉積在肝臟、脾臟、心臟和內(nèi)分泌器官，造成損傷。肝臟是過量的鐵最主要沉積部位(70%～90%)[2]，因此肝鐵濃度(liver iron concentration, LIC)是反映體內(nèi)鐵含量最重要指標[3]。去鐵治療可以顯著改善患者的生存期和生存質(zhì)量，測量肝臟鐵含量對臨床診斷、制定與修改治療方案和評價去鐵藥物療效等都非常重要。

目前國內(nèi)測量LIC常規(guī)使用肝臟穿刺，再用化學方法測定活檢物鐵含量。這種有創(chuàng)的方法雖能直接評估鐵負荷，但每次只穿刺肝臟一個點(樣本量必須＞0.5 mg干重)，存在變異誤差，且不能頻繁進行，患者難以常規(guī)檢查。自從發(fā)現(xiàn)組織鐵濃度與MR弛豫時間(T1、T2及T2*)兩者有相關(guān)關(guān)系以來，大量動物及臨床研究已證實使用MRI檢查方法可以準確及無創(chuàng)定量肝鐵水平并已應(yīng)用于臨床，但這些研究主要都是應(yīng)用1.5 T MRI[4-9]。目前，3.0T MRI數(shù)量增長迅速，尤其在我國有的醫(yī)療機構(gòu)甚至只有3.0T。由于弛豫時間具有場強依存性，1.5 T MRI獲得的肝鐵濃度與弛豫時間的標準曲線并不適用于3.0T。目前只有少數(shù)1.5 T和3.0T MRI肝臟鐵定量的臨床對比研究[9-11]，尚需進行動物實驗探討3.0T場強下弛豫時間與實際肝臟鐵含量之間的關(guān)系作為基礎(chǔ)。利用沙鼠建立的鐵超負荷模型可以模擬人體的鐵沉積過程[12-14]，但是沙鼠的肝臟體積太小，難以使用臨床用MRI進行掃描及測量。

因此，本研究的目的是利用家兔建立肝鐵超負荷模型探討3.0T場強下肝臟T2弛豫時間、肝臟/肌肉信號強度比值(signal intensity ratios, SIR)與LIC的關(guān)系，進而證明3.0T MRI定量肝鐵沉積的可行性。

1 材料與方法

1.1 動物模型

廣西醫(yī)科大學動物實驗中心提供的新西蘭雄性家兔44只，3～5月齡，體重2.0～2.9 kg。隨機分為3組，實驗組30只，對照組2只，驗證組12只。普通飼料喂養(yǎng)。實驗組及驗證組每周一注射1次右旋糖酐鐵(含鐵量150000mg/L，廣西化工研究院獸藥廠)，劑量為15 mg/kg，兩側(cè)后大腿輪流肌注。實驗組于1～15周周日隨機選取2只行肝臟MRI檢查；驗證組分別在1～5、8、9及11～15周周日隨機選取1只檢查；對照組不注射鐵劑，與實驗組相同時間點檢查。實驗組2只與驗證組1只家兔檢查結(jié)束后即處死(第15周連同對照組一并處死)，取出肝臟行病理、鐵含量等檢查。本研究通過廣西醫(yī)科大學動物福利倫理委員會批準。

1.2 LIC測定及病理學檢查

家兔處死后，取完整肝臟并在各肝葉隨機取6塊肝組織放入固定液固定12 h后，蠟埋、切片，行普魯士藍染色及HE染色。取完病理的肝臟每葉切成2塊，去掉大的血管及膽管后，用雙蒸水反復沖洗8～10次，于60℃烤箱烘干至肝臟組織重量不再改變。烘干后肝臟組織送廣西分析測試研究中心經(jīng)原子吸收分光光度計測定LIC。

1.3 MRI檢查及數(shù)據(jù)采集

使用荷蘭產(chǎn)Philips Achieva 3.0T MR掃描儀，膝關(guān)節(jié)軟線圈及呼吸門控采集。T2值測量采用8回波SE序列：TR 2000.0ms，TE 8.0～64.0ms (間隔8 ms)，偏轉(zhuǎn)角度 90°，F(xiàn)OV 120mm×100mm，層厚 4 mm，層距 2 mm，掃描肝臟最大同層截面，最后生成T2-Map圖。肝臟/肌肉SIR測量采用GRE序列：TR 48.0ms，TE 2.5 ms，偏轉(zhuǎn)角度 60°，F(xiàn)OV 120mm×100mm，層厚 4 mm，層距 2 mm，掃描4層肝臟。選用Philips MR自帶軟件測量。掃描后在肝臟T2-Map圖像上，避開肉眼可見的血管、膽管分別畫5個相同面積(約1 cm×1 cm)的ROI，以避免由于鐵分布不均造成的影響，軟件測得值即T2值。求5個ROI的T2平均值，即為肝臟平均T2值。R2值(R2弛豫率)為T2值的倒數(shù)(R2=1/T2)。在GRE掃描所得4層圖像中選取肝臟最大截面一層，同樣避開肉眼可見血管、膽管，畫5個ROI，分別測信號強度(signal intensity, SI)后求其平均值，即為肝臟平均SI；在右側(cè)豎脊肌避開脂肪組織，畫1個ROI測值即為肌肉SI。SIR(肝臟/肌肉)=SI(肝臟平均)/SI(肌肉)。

1.4 統(tǒng)計方法

使用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。用簡單隨機分組設(shè)計分組。實驗組、驗證組肝臟T2值、R2值及SIR(肝臟/肌肉)經(jīng)正態(tài)性檢驗不符合正態(tài)分布。用完全隨機設(shè)計兩樣本秩和檢驗比較實驗組與對照組肝臟T2值、SIR(肝臟/肌肉)之間差異。用Spearman相關(guān)分析探討肝臟R2值、SIR(肝臟/肌肉)和LIC之間的關(guān)系，并用直線回歸分別獲得其擬合直線的斜率、截距，得到通過R2值或SIR預測LIC的公式。計算驗證組實際LIC與通過預測公式得到的LIC的組內(nèi)相關(guān)系數(shù)(ICC)。用Bland–Altman圖分析兩種方法所得驗證組的LIC之間是否一致性。P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 病理

表1 實驗組30只家兔肝臟T2值、SIR肝臟/肌肉及LIC的中位數(shù)、范圍Tab.1 Median, maximum, and minimum values of SIR, T2, and LIC in the Iron overloaded group

表2 驗證組12只家兔經(jīng)預測公式所得的LIC與實際的LIC的中位數(shù)、范圍Tab.2 Median, maximum, and minimum values of LIC by the equations and spectrophotometer of 12 iron overloaded rabbits

圖1～6 圖1、3、5分別為第1、4、15周家兔肝臟鏡下病理(普魯士蘭染色×40)，圖2、4、6為相應(yīng)的肝臟MR圖像。隨著鐵劑注射劑量增加，肝臟沉積鐵顆粒(藍色)逐漸增多，MR圖像上肝臟信號減低Fig.1－6 An example Liver MR image (Fig.2, 4, 6) and corresponding Prussian blue staining (Prussian blue ×40) of liver at the fi rst (Fig.1), forth (Fig.3), and fifteenth (Fig.5) week of iron dextran loading.As dextran iron injection increased over time, the liver iron deposits (blue) increased accordingly, and caused a decrease of signal intensity on liver MR image.

對照組家兔肝臟切片普魯士藍染色未見鐵顆粒。注射右旋糖酐鐵1周后，實驗組家兔肝臟切片僅見少數(shù)肝小葉內(nèi)有少量鐵顆粒，大部分肝小葉未見鐵染色(圖1, 2)。隨著右旋糖酐鐵注射次數(shù)增加，肝臟鐵含量逐漸增高。3周后，不僅肝竇內(nèi)有鐵沉積，肝細胞內(nèi)亦可看到鐵沉積(圖3, 4)。10周后，肝竇、肝細胞的細胞質(zhì)內(nèi)都充滿了含鐵血黃素顆粒(圖5, 6)。

2.2 兩組肝臟MRI測量和LIC測定結(jié)果

對照組肝臟T2均值為(55.4±6.2) ms，SIR(肝臟/肌肉)均值為1.3±0.1。實驗組肝臟T2值、SIR(肝臟/肌肉)及LIC的中位數(shù)、范圍如表1。實驗組與對照組肝臟T2值、SIR(肝臟/肌肉)相比，兩者之間差異有統(tǒng)計學意義(T2：Z=﹣6.473, P=0.000；SIR：Z=﹣5.378, P=0.000)。

2.3 實驗組肝臟R2值、SIR(肝臟/肌肉)與LIC相關(guān)性

肝臟R2值與LIC呈顯著直線正相關(guān)(r=0.948,P=0.000；圖7)。SIR(肝臟/肌肉)與LIC呈顯著直線負相關(guān)(r=－0.845, P=0.000；圖8)。根據(jù)線性回歸，分別得到R2、SIR(肝臟/肌肉)與LIC擬合直線的斜率為96.426、－5.924，截距為－0.920、10.581，建立兩者之間的回歸方程如下。

以上X1為R2值，X2為SIR(肝臟/肌肉)，Y為預測的LIC。

2.4 重復性及預測LIC公式的準確性

12只驗證組家兔經(jīng)過以上預測公式所得的LIC與經(jīng)分光光度計測量的LIC的中位數(shù)及范圍見表2。通過所得公式，R2值、SIR (肝臟/肌肉)預測的LIC與實際的LIC之間ICC分別為0.953、0.914，經(jīng)Bland-Altman圖分析也具有高度的一致性(圖9, 10)

圖7,8 分別為R2值、SIR與LIC之間的散點圖。實線為兩者之間的擬合直線，虛線為95.0% CI圖9,10 分別為利用公式1、2和原子分光光度計所得的LIC之間的Bland-Altman圖。圖中水平實線表示兩種方法所得LIC差值的均數(shù)，水平虛線表示差值的95.0%的分布范圍Fig.7, 8 Scatter plots of R2(Fig.7), SIR (Fig.8) against LIC with the linear fi t (solid line)and the 95% CI (dashed lines).Fig.9,10 Bland-Altman plots showing the differences between LIC(R2) (Fig.9) and LICSIR (Fig.10)and LICspectrophotometer.The solid line shows the mean difference between the 2 measurements, whereas the dashed lines indicate the upper and lower 95% bounds of agreement between the 2 measurements.

3 討論

通過建立鐵超負荷兔模型，本研究證實了使用3.0T MRI測量肝臟R2值、SIR(肝臟/肌肉)與LIC(＜10mg/g干重)之間高度線性相關(guān)，利用3.0T MRI預測一定范圍的LIC具有可行性。

人體不能排出過量的鐵，肝臟中的鐵主要以鐵蛋白和含鐵血黃素的形式存在。然而，大多數(shù)其他哺乳動物卻能以不同的速度排出體內(nèi)多余的鐵[15]。因此難以選擇適合的實驗動物建立完全模擬人體組織鐵沉積過程的動物模型。本研究通過病理證實發(fā)現(xiàn)使用家兔建立鐵超負荷MRI定量肝鐵模型確實可行。因為經(jīng)過證實沙鼠可以較好模擬人體鐵沉積，所以大多數(shù)臨床鐵負荷研究常常選用其作為實驗對象。本研究中筆者發(fā)現(xiàn)病理上家兔肝臟鐵沉積模式與沙鼠及人類非常相似。隨著右旋糖酐鐵注射劑量的增加，家兔鐵超負荷加重，鐵顆粒首先沉積在肝臟門靜脈周圍，然后逐漸在肝小葉的中心靜脈旁沉積，直到累及整個肝實質(zhì)細胞。家兔體重及肝臟體積[本研究中實驗組兔肝臟經(jīng)排水法測量體積為(91±16) ml)]相對沙鼠都較大，利于進行MRI掃描。此外，在其肝臟MR圖像上避開主要的血管、膽管選取均一的肝實質(zhì)區(qū)域作為ROI也較容易，減少了測量誤差，提高準確性。

使用3.0T MRI這種無創(chuàng)的檢查方法，本研究比較了R2值、SIR與實際LIC之間的關(guān)系。結(jié)果顯示在一定范圍的LIC內(nèi)，R2值與LIC的相關(guān)性高于SIR。此結(jié)果與其他研究發(fā)現(xiàn)相似[16]。原因可能是R2值更為直接地反映了沉積在組織中的鐵造成的弛豫時間縮短，而SIR是對T2WI的間接評估。雖然通過鐵超負荷動物模型證實使用SIR這種方法可以定量LIC，但由于不同MR掃描儀之間的差異性使SIR相互比較存在困難。而且采用僅1個回波時間的GRE序列測量SIR，對重度肝鐵沉積敏感性減低，因此不能評估一些范圍的重度鐵沉積。

使用3.0T MRI定量肝臟鐵沉積也存在一定局限。首先，與1.5 T MRI比較，3.0T MRI磁敏感偽影和移動偽影更為顯著，因此必須改進勻場方法[17]。其次，在3.0T MRI組織信號衰減加快，由于MR機器硬件對最小回波時間的限制，這也限制了可檢測到組織鐵沉積的最大含量，尤其不利于對鐵沉積較多的肝臟檢查[9-10]。近期1篇文獻報道患者的LIC＞37 mg/g 干重時使用3.0T無法準確定量[9]。雖然有局限，但對于臨床鑒別肝鐵沉積嚴重程度的幾個重要界值(1.8、3.2、7.0、15.0mg/g干重[18])，使用3.0T還是可以準確測量，這些已經(jīng)可以對臨床診斷肝鐵沉積及制定去鐵方案提供幫助。最后，本研究通過探討R2、SIR與實際LIC之間關(guān)系而推導的預測公式是在肝鐵沉積動物模型上建立的，因此可能不能直接應(yīng)用于鐵超負荷患者。因為家兔鐵沉積的病理生理特點可能與人類不盡相同，解決上述問題需要更進一步研究。

綜上所述，本研究通過建立肝鐵沉積兔模型證明使用3.0T MRI 參數(shù)SIR、R2值在一定LIC范圍內(nèi)定量鐵沉積具有可行性。隨著3.0T MR掃描儀在醫(yī)療機構(gòu)數(shù)量逐漸增多，本研究對高場強下評估鐵超負荷患者肝鐵沉積的可行性奠定了基礎(chǔ)。

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