植物甾醇-共軛亞油酸酯對結腸癌細胞增殖的抑制作用

田 莉 莉, 王 際 輝, 葉 淑 紅, 王 晗

( 大連工業(yè)大學 遼寧省食品生物技術重點實驗室, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

近年來,大腸癌的發(fā)病率不斷提高[1],該病在印度、南美、非洲等欠發(fā)達地區(qū)的發(fā)病率明顯較低,這可能與飲食習慣有關。流行病學調查表明,低脂肪、低蛋白、高膳食纖維飲食可以降低大腸癌的發(fā)病率。

植物甾醇是一種存在于植物中的天然活性物質,具有抗腫瘤、抗病毒、防治前列腺疾病、消炎退熱[2]的等多種生理功能。但是由于植物甾醇水溶性和脂溶性都很差,大大限制了其生理功能的發(fā)揮。因此對植物甾醇進行改性,提高其水溶性和脂溶性,進而擴大其應用范圍和提高其生理功能一直是重要研究方向之一。共軛亞油酸是由亞油酸衍生的共軛雙烯酸的多種位置和幾何異構體的總稱,具有防癌[3]、減肥[4]、增強免疫[5]等生理功能。但共軛亞油酸由于雙鍵的存在,極易氧化,生理功能也因此受限。植物甾醇-共軛亞油酸酯(PCLA)與植物甾醇相比,其利用吸收率提高了約5倍；與共軛亞油酸相比,抗氧化性有所提高,應用范圍和前景更加廣泛,是一種新型藥物。目前對植物甾醇酯抗腫瘤生物活性還未見文獻報道,本實驗就植物甾醇-共軛亞油酸酯對結腸癌HT-29細胞增殖的抑制作用和可能的作用機制作了初步探討。

1 實 驗

1.1 原 料

植物甾醇-共軛亞油酸酯由大連工業(yè)大學提供,共軛亞油酸由大連醫(yī)諾生物技術有限公司提供。用50%的DMSO溶解配制成200 mmol/L的儲藏液,分裝后置于-20 ℃?zhèn)溆?；結腸癌細胞株HT-29由大連醫(yī)科大學提供；RPMI1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清(FBS),Hyclone 公司；四甲基偶氮唑藍(MTT)干粉,Sigma公司；TECAN SUNRISE酶標儀,Tecan Austia GmbH；MCO-17A CO2恒溫培養(yǎng)箱,日本三洋電機株式會社；AE30/31倒置熒光顯微鏡,廈門Motic公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

將結腸癌細胞HT-29置于含10%新生牛血清、青霉素(100 μg/mL)、鏈霉素(100 μg/mL)的RPMI 1640培養(yǎng)液中,于37 ℃、體積分數5%的CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 生長曲線測定

常規(guī)培養(yǎng)結腸癌HT-29細胞48 h,消化,用含10%的小牛血清、青霉素(100 μg/mL)、鏈霉素(100 μg/mL)的RPMI 1640培養(yǎng)液,調整細胞濃度為1×105個cell/well,接種于24孔板,每孔500 μL,每天每組3個重復孔,于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)7 d,每隔12 h吸去3個孔的培養(yǎng)液,消化、離心、重懸細胞,計算細胞數目。每個孔計數2次,得出細胞濃度的平均值,繪制生長曲線。

1.4 MTT法測定細胞增殖

將處于對數生長期的結腸癌HT-29細胞,用0.25%胰蛋白酶消化,加入含10% FBS的RPMI 1640 培養(yǎng)液,吹打混勻后計數,離心,棄舊培養(yǎng)液,加入新的培養(yǎng)液,制成細胞懸液。調整細胞密度為1×105個/mL,接種于96孔培養(yǎng)板中,每孔100 μL,常規(guī)培養(yǎng)24 h,使細胞貼壁。將細胞培養(yǎng)液更換為含1%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液,每孔100 μL,培養(yǎng)6 h,使細胞同步化。細胞分為實驗組(終濃度分別為50、100、150、200、250 μmol/L) 和空白組(直接加等體積的無血清且與實驗組含有等量DMSO的RPMI 1640培養(yǎng)液),以上各組均設9個復孔,繼續(xù)培養(yǎng)20、44、68 h,每個時間吸棄3個復孔中的液體,每孔加入0.5 mg/mL的MTT培養(yǎng)液(20 μL 0.5 mg/mL MTT,溶于80 μL無血清RPMI 1640培養(yǎng)液)100 μL,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,用PBS 清洗細胞表面1次,每孔加入150 μL DMSO,室溫振蕩混勻10 min,使結晶紫完全溶解,用酶標儀檢測細胞570 nm處的吸光值,以空白組為對照組,其細胞活力為100%。其余各組計算細胞增殖抑制率:抑制率=(1-實驗組A值/對照組A值)×100%。

1.5 細胞形態(tài)學觀察

結腸癌HT-29細胞在不同濃度植物甾醇-共軛亞油酸酯培養(yǎng)液中培養(yǎng)48 h,用倒置熒光顯微鏡觀察細胞形態(tài)。

1.6 統計學分析

2 結果與討論

2.1 植物甾醇-共軛亞油酸酯對HT-29增殖的影響

用100～300 μmol/L植物甾醇-共軛亞油酸酯分別處理HT-29細胞24、48、72 h后,用MTT法研究細胞活力。結果由表1和圖1可見,HT-29細胞活力與藥物濃度及藥物作用時間有很大關系。與對照組相比,植物甾醇-共軛亞油酸酯的濃度達到100 μmol/L對結腸癌HT-29細胞增殖有明顯的抑制作用(P<0.01),用100～300 μmol/L 植物甾醇-共軛亞油酸酯處理24 h后,細胞的存活率呈劑量依賴性下降趨勢(P<0.05)；用植物甾醇-共軛亞油酸酯處理48或72 h后,細胞的存活率亦顯著呈劑量依賴性下降趨勢(P<0.05),在72 h植物甾醇-共軛亞油酸酯濃度為300 μmol/L時,細胞增殖抑制率達93.98%。

表1 植物甾醇-共軛亞油酸酯對HT-29細胞增殖的影響

圖1 植物甾醇-共軛亞油酸酯對HT-29細胞活力的影響

Fig.1 Effect of PCLA on cell viability in HT-29 cells

2.2 植物甾醇-共軛亞油酸酯對HT-29細胞形態(tài)的影響

不同濃度植物甾醇-共軛亞油酸酯作用HT-29細胞24 h,倒置熒光顯微鏡觀察結果如圖2所示。圖2中空白對照組HT-29細胞邊緣清晰、胞質均勻,呈良好的貼壁生長狀態(tài)。當植物甾醇-共軛亞油酸酯物質的量濃度為100 μmol/L時,HT-29細胞狀態(tài)開始改變,隨著劑量的增加,細胞狀態(tài)逐漸變差,胞質混濁,體積縮小,折光性變差,圓形懸浮、脫落而死亡的細胞數量逐漸增大。從圖2可以看出,植物甾醇-共軛亞油酸酯對HT-29細胞生長有明顯地抑制作用,作用效果隨濃度的增加而增強。

圖2 植物甾醇-共軛亞油酸酯對細胞形態(tài)的影響(×200倍)

Fig.2 Effect of PCLA on morphocytology

3 結 論

采用MTT比色法檢測不同濃度的植物甾醇-共軛亞油酸酯對體外培養(yǎng)結腸癌HT-29細胞增殖的影響。結果表明,植物甾醇-共軛亞油酸酯對結腸癌細胞HT-29 的生長和增殖有抑制作用,且以劑量-效應、時間-效應依賴的方式抑制增殖,使細胞增殖減緩,數目減少,體積變小。目前關于甾醇酯類抗腫瘤作用機制方面的研究還不夠系統和深入,多數研究仍停留在藥效觀察水平,有待于進一步研究。

[1] PISANI P, BRAY F, PARKIN D M. Estimates of the world-wide prevalence of cancer for 25 sites in the adult population[J]. International Journal of Cancer 2002, 97(16):72-81.

[2] 亦森. 植物甾醇和植物甾烷醇的生理功能[J].糧食與油脂, 1999(1):46-47.

[3] LIN H, BOYLSTON T D, CHANG M J, et al. Survey of the conjugated linoleic acid contents of dairy products[J]. Journal of Dairy Science, 1995, 78(11):2358-2365.

[4] BAUMGARD L H, CORL B A, DWYER, D A, et al. Identification of the conjugated linoleic acid isomer that inhibits milk fat synthesis[J]. American Journal of Physiology, 2000, 278(1):179-184.

[5] YAMASAKI M. Immunoglobulin and cytokine production from spleen lymphocytes is modulated in C57BL/6J mice by dietary cis-9, trans-11 and trans-10, cis-12 conjugated linoleic acid[J]. The Journal of Nutrition, 2003, 133(3):784-788.