針灸對(duì)帕金森小鼠模型運(yùn)動(dòng)機(jī)能調(diào)節(jié)的分子機(jī)制研究

黃 慶 孫艷紅 王 璐 張 一 諸 穎 李曉明 孔華庭 王少朋 胡 鈞 樊春海

(中國科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所 嘉定園區(qū) 上海 201800)

針灸早在公元前 2000年就成為一種防治疾病的手段，是以針刺或艾灸身體的穴位，并通過全身經(jīng)絡(luò)的傳導(dǎo)，來調(diào)理氣血和臟腑功能，從而達(dá)到治病防病的目的。相對(duì)于藥物來說，針灸具有療效好、操作簡單、副作用低的優(yōu)勢(shì)。為什么對(duì)機(jī)體特殊部位(穴位)進(jìn)行這種針刺或熱療就能防治疾病, 是一直以來都比較受關(guān)注的課題，盡管穴位和經(jīng)絡(luò)的本質(zhì)問題都還在探索之中，還處于假說的驗(yàn)證階段，但是針灸的臨床效果在國際上有目共睹，在20世紀(jì)70年代末針灸作為一種治療疾病的手段，相繼得到了世界衛(wèi)生組織(WHO)和美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)的肯定和認(rèn)可，尤其在緩解疼痛，改善偏癱后遺癥等運(yùn)動(dòng)障礙有較好的臨床療效。

帕金森病(Parkinson disease，PD) 又名震顫性麻痹，是中老年人常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病[1]。其主要病理改變?yōu)橹心X黑質(zhì)致密部多巴胺(DA)能神經(jīng)元進(jìn)行性變性丟失，紋狀體區(qū)多巴胺含量減少，以及殘存的多巴胺能神經(jīng)元內(nèi)形成以a-突觸共核蛋白(a-syn)為主要成分的嗜酸性包涵體—路易小體(Lewy body，LB)生成為主要的病理特征[2-5]。近年來臨床研究證實(shí), 采用頭針、體針等方案治療針灸可以有效改善帕金森病的震顫、肌肉僵直、運(yùn)動(dòng)障礙等癥狀，實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)針灸可以改善MPTP導(dǎo)致的PD小鼠模型的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性，增加中腦黑質(zhì)內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量，提高了腦內(nèi)多巴胺的利用率[6-9]，2007年的Nature news專門有篇關(guān)于針灸治療PD的報(bào)道，提示針灸在PD的防治中具有較好的應(yīng)用前景。針刺遠(yuǎn)端肢體的穴位，能夠緩解 PD這種腦部病變引起的癥狀，其分子機(jī)制一直受到極大的關(guān)注。本工作利用MPTP腹腔注射建立PD模型，并探討針灸對(duì)其運(yùn)動(dòng)機(jī)能的影響及其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

MPTP、Lamp1、a-synuclein一抗、二抗購于Sigma，華佗牌針灸針，規(guī)格0.19 mm ′10mm，華佗牌針刺手法診療儀，型號(hào) SXDZ-100，中國蘇州醫(yī)療用品廠有限公司；BCA蛋白測(cè)定試劑盒，碧云天生物技術(shù)有限公司。電泳儀，BIO-RAD。

1.2 動(dòng)物

ICR小鼠，雄性，體重28–30g，購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)：SCXK(滬)2007-0005。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法[6-9]

1.3.1 分組及治療

小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)分為生理鹽水組，MPTP組，針灸治療組。針灸穴位選取陽陵泉（GB34）穴，用針刺手法針療儀進(jìn)行捻轉(zhuǎn)手法刺激，連續(xù)15s。生理鹽水組和MPTP組在實(shí)驗(yàn)第1天開始分別腹腔注射生理鹽水和MPTP (30mg/kg)，每天1次，連續(xù)5天，在每次注射MPTP后2h針灸治療。

1.3.2 旋棒儀進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)

于試驗(yàn)第5天，針灸治療后30min，用旋棒儀進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試，轉(zhuǎn)速為 20r/min，測(cè)定前訓(xùn)練 3次，記錄在2min內(nèi)第1次掉落的時(shí)間(潛伏期)，超過2min以2min計(jì)。

1.3.3 透射電鏡標(biāo)本取材及固定

MPTP停止注射后繼續(xù)針灸7天，于末次治療后30min，每組取1只小鼠進(jìn)行心臟灌注，將針頭插入左心室，先緩慢推注30mL生理鹽水，然后再快速推注20mL 4%多聚甲醛固定液，然后用小鼠腦切片模具取中腦黑質(zhì)部位，切成1mm3的小塊放入2.5%的戊二醛固定液，送透射電鏡觀察。

1.3.4 western blot蛋白樣品取材

小鼠脫頸椎處死，取中腦黑質(zhì)部位放于液氮保存，次日取出進(jìn)行蛋白裂解，測(cè)定蛋白濃度后，進(jìn)行 western blot 檢測(cè) Lamp1、a-synuclein的蛋白表達(dá)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 小鼠模型的構(gòu)建及針灸的治療效果

對(duì)小鼠的針灸如圖1所示。小鼠在注射MPTP后 1h左右出現(xiàn)活動(dòng)減少，豎毛、豎尾等表現(xiàn)，在注射 3天后就開始出現(xiàn)輕度的靜止性震顫, 運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性下降。

圖1 對(duì)小鼠GB34穴位進(jìn)行針灸處理Fig. 1 Acupuncture treatment at acupoint GB34 in mice.

圖2 為注射MPTP 5天后用旋棒儀進(jìn)行的行為學(xué)測(cè)試結(jié)果，生理鹽水組大多數(shù)都在 120s以上，MPTP組在棒上時(shí)間明顯減少，大部分在10s以內(nèi)，而針灸治療組掉落潛伏期較MPTP組明顯延長，說明針灸可以改善MPTP導(dǎo)致的帕金森模型小鼠運(yùn)動(dòng)的協(xié)調(diào)性。

圖2 針灸GB34穴位對(duì)帕金森模型小鼠行為學(xué)的影響Fig.2 Effect of acupuncture treatment on motor function in Parkinson’s disease mice model.

2.2 中腦黑質(zhì)Lamp1、a-synuclein蛋白表達(dá)

取中腦黑質(zhì)后進(jìn)行蛋白裂解，分別對(duì)Lamp1、a-synuclein蛋白表達(dá)情況進(jìn)行了western blot檢測(cè)，結(jié)果見圖3。與生理鹽水組比較，注射MPTP組的溶酶體膜蛋白Lamp1的表達(dá)明顯下降，a-synuclein蛋白的表達(dá)上升，提示MPTP引起的小鼠黑質(zhì)致密部的溶酶體膜破壞導(dǎo)致了清除a-synuclein的能力下降。針灸GB34穴后，可以增加溶酶體膜蛋白的表達(dá)，減輕 MPTP對(duì)溶酶體膜蛋白的損傷，促進(jìn)a-synuclein蛋白的有效降解。結(jié)果提示針灸可能能通過改善溶酶體的功能，從而促進(jìn)了a-synuclein蛋白的降解。眾所周知，蛋白酶體和自噬系統(tǒng)是清除缺陷蛋白的兩大重要途徑，由針灸引發(fā)的a-synuclein蛋白降解很有可能是來自自噬水平的上升所致。

圖3 針灸GB34穴位對(duì)帕金森模型小鼠黑質(zhì)Lamp1、a-synuclein蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effect of acupuncture treatment on protein expression of Lamp1 and a-synuclein.

2.3 針灸對(duì)PD小鼠模型黑質(zhì)超微結(jié)構(gòu)的影響

對(duì)各組小鼠黑質(zhì)的電鏡結(jié)果發(fā)現(xiàn)：正常對(duì)照組核膜完整，線粒體結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞器結(jié)構(gòu)清晰，溶酶體結(jié)構(gòu)完整；MPTP組出現(xiàn)核膜破損，核質(zhì)彌散，有邊集情況，線粒體腫脹空泡化，溶酶體數(shù)量減少，細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)大量的雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小泡；針灸組線粒體的損害明顯減輕，溶酶體數(shù)量明顯增多，能見到與溶酶體體融合的自噬體。提示針灸可以改善MPTP引起溶酶體減少和自噬體積累的情況，使a-Synuclein 蛋白能夠有效清除，從而改善帕金森模型的運(yùn)動(dòng)障礙。

圖4 針灸GB34穴位對(duì)帕金森模型小鼠黑質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響(′5000倍) (a) 正常對(duì)照 (b) 模型組 (c) 針灸組Fig.4 Effect of acupuncture treatment on dopaminergic neurons cell structure in the substantia nigra detected by TEM.(a) Control (b) MPTP (c) Acupuncture(AP)

3 討論

針灸作為一種通過對(duì)身體體表面穴位進(jìn)行刺激或熱療的物理療法，達(dá)到治病防病的目的，受到廣大患者的歡迎。尤其在像中風(fēng)偏癱、帕金森等運(yùn)動(dòng)障礙性疾病的治療和康復(fù)方面，起著舉足輕重的作用。但是對(duì)其作用機(jī)制方面的研究卻非常少，許多治療效果得不到客觀合理的解釋，就使得針灸具有了神秘的傳奇色彩。借助先進(jìn)的檢測(cè)手段和現(xiàn)代的醫(yī)學(xué)理論將有助于我們探求針灸的作用機(jī)制及經(jīng)絡(luò)和穴位的本質(zhì)。針灸對(duì)多種病具有療效，這種作用實(shí)質(zhì)上有一個(gè)共同點(diǎn)，就是通過穴位刺激，使人體氣血通暢，重新回復(fù)一個(gè)平衡狀態(tài)，即機(jī)體層面的穩(wěn)態(tài)。

細(xì)胞自噬是近年來提出的一個(gè)對(duì)維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)有重要意義的生理現(xiàn)象，是細(xì)胞在應(yīng)激狀態(tài)下自保和更新的一種機(jī)制。近年來的研究表明，自噬在PD的發(fā)病過程占有非常重要的地位。經(jīng)過MPP處理的神經(jīng)細(xì)胞、MPTP造的小鼠模型和PD病人的中腦黑質(zhì)中都出現(xiàn)了溶酶體的缺失和自噬體的積累，因?yàn)槿苊阁w膜的通透性改變，蛋白酶外泄，導(dǎo)致自噬體不能與溶酶體融合，不僅大量的有毒蛋白如a-synuclein不能有效清除，而且溶酶體內(nèi)的蛋白酶外泄后還會(huì)損傷正常的細(xì)胞及細(xì)胞器，導(dǎo)致多巴胺神經(jīng)元功能受損[10-12]。因此,穩(wěn)定溶酶體膜及其功能、調(diào)節(jié)自噬降解通路是治療PD的又一新的途徑。

用MPTP制備的帕金森小鼠模型是目前國內(nèi)外應(yīng)用比較廣的模型, 可以出現(xiàn)類似帕金森病人的運(yùn)動(dòng)不協(xié)調(diào)和中腦黑質(zhì)的多巴胺損傷的病理變化。該模型小鼠由于溶酶體功能受到破壞，導(dǎo)致自噬通路中斷，進(jìn)而產(chǎn)生毒性蛋白累積。在本研究中發(fā)現(xiàn)，通過針灸治療能一定程度上改善溶酶體的功能，使累積的自噬體減少，促進(jìn)a-synuclein 蛋白的降解，從而調(diào)節(jié)了帕金森模型的自噬。Western blot的結(jié)果也支持這一結(jié)論，表現(xiàn)為 Lamp1蛋白表達(dá)上升，a-synuclein蛋白表達(dá)有所下降。這些結(jié)果提示，針灸可能通過調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞自身的自噬水平來清除過度積累的毒性蛋白，從而保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受毒性蛋白的損傷，改善PD小鼠的運(yùn)動(dòng)障礙。應(yīng)該指出，本次實(shí)驗(yàn)中使用小鼠的規(guī)模較小，還必須進(jìn)行更大樣本的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來得到更加準(zhǔn)確，更有說服力的證據(jù)。綜上所述，本論文在揭示針灸治療帕金森病的作用及機(jī)理方面提供了一條新的思路，其詳細(xì)的作用機(jī)制，尤其是自噬水平上升的確認(rèn)以及針灸刺激如何轉(zhuǎn)導(dǎo)到中腦黑質(zhì)發(fā)揮作用等，都需要進(jìn)一步系統(tǒng)深入的研究。

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