TDI誘發(fā)變應(yīng)性鼻炎豚鼠模型的建立

肖紅兵，謝彥兵，李寶國，李海兵，，邸嬋娟，胡 明，劉永學(xué)

(本文編輯:張仲書; 英文編輯:王建東)

變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis，AR)是一種特異性呼吸道疾病，發(fā)病率一直呈上升趨勢，其臨床的特征是鼻充血、鼻塞、鼻涕、噴嚏、鼻癢，有時也會失去嗅覺［1］，嚴重影響人們的身體健康和生活質(zhì)量。

開展AR的實驗研究，往往離不開理想的動物模型。就AR動物模型而言，目前國內(nèi)外公認的方法即甲苯-2，4-二異氰酸酯(TDI)或卵清蛋白(OVA)誘導(dǎo)法［2-3］。前者具有建模周期短、操作方便、試劑便宜等優(yōu)點，但目前大多文獻報道的實驗方案不夠詳盡和完善，并且在實驗過程中經(jīng)常有動物死亡等現(xiàn)象。本研究在前期預(yù)實驗的基礎(chǔ)上，優(yōu)化了TDI誘發(fā)AR豚鼠模型的方案，取得了滿意的結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級Hartley豚鼠30只，雌雄各半，體重400～450 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物合格證號:SCXK(京)2006-0009。由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院豐臺動物中心飼養(yǎng)，每籠5只，環(huán)境溫度:(23±2)℃，濕度:(55±5)%，動物自由攝食攝水。

1.2 試劑 TDI(天津市津科精細化工研究所，批號:20031012)，橄欖油(國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號:F20081006)，布地奈德鼻噴霧劑(阿斯利康制藥有限公司，批準文號:國藥準字J20090079，批號:F20081006)，烏來糖(氨基甲酸乙酯)(國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號:T20080917)，生理鹽水(石家莊四藥有限公司，批號:100427117)，豚鼠免疫球蛋白E(IgE)ELISA試劑盒(北京中昊時代生物技術(shù)中心，批號:20100817)，磷酸組胺對照品(中國藥品生物制品檢定所批號:150510-200412)等。

1.3 儀器及器械 微量移液器(法國GILSON)，臺式高速離心機(Sigma公司)，海爾超低溫保存箱(青島海爾特種電器有限公司)，全自動酶標儀(Thermo Multiskan MK3公司)，高效液相Waters2695及多通道熒光檢測器Waters 2475(沃特世科技有限公司)。

1.4 動物分組及模型制作方法

1.4.1 分組 將30只SPF級豚鼠根據(jù)體重隨機分為三組，分別為正常對照組、AR模型組，布地奈德噴鼻劑治療組，每組10只，雌雄各半。

1.4.2 建模 致敏方案遵照 Tanaka等［3］報道方法，部分作修改。除正常對照組外，其他兩組豚鼠用10%TDI(分別取0.1ml TDI和0.9ml橄欖油，在常溫下將兩者充分混勻即得濃度為10%的TDI溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用)進行雙側(cè)鼻孔滴鼻，用量按每側(cè)12.5 μl/kg計算，每日1次，連續(xù)7 d后，改為隔日1次，直至第21天結(jié)束。從第一次給予TDI開始，每天觀察并記錄每只動物的臨床癥狀，根據(jù)癥狀評分標準，計算臨床評分。在TDI滴鼻第7天，致敏動物評分若超過5分，則表明動物模型制作成功。正常對照組豚鼠，以橄欖油替代10%TDI，用法、用量與上述模型組相同。

評分標準:以鼻部癥狀和體征為主要觀察內(nèi)容，自給10%TDI開始，依據(jù)鼻癢、噴嚏、流涕等出現(xiàn)的時間長短、輕重程度、次數(shù)多少為評分標準并記錄。鼻癢程度:輕擦鼻幾次，記1分;連續(xù)抓撓鼻、面部記2分。噴嚏:1～3個為1分，4～10個為2分，11個以上為3分。流涕:流至鼻前孔為1分，超過鼻前孔為2分，流涕滿面為3分。各癥狀記分累加，即為臨床評分。其癥狀觀察時間為每次給致敏物開始計時，共 30 min。

1.5 給藥方案 布地奈德給藥組豚鼠從第8天開始給藥，經(jīng)雙側(cè)滴鼻給藥，每側(cè)鼻孔給藥用量為10 μl/kg，每天給藥1次，連續(xù)14 d。若給藥當天動物需TDI激發(fā)，則在給藥60min后再用TDI，隨后進行相應(yīng)的癥狀評分。正常對照、模型組動物，按照給藥組相同的方案均給予等體積生理鹽水。

最后一次給藥、評分完畢，以25%的烏拉坦(1 g/kg)經(jīng)腹腔注射麻醉動物，腹主動脈取血3～5 ml于離心管中，再經(jīng)離心制備血清，－80℃保存，用于檢測血清IgE含量。然后沿豚鼠鼻道切開，暴露鼻中隔，小心分離取出鼻中隔兩側(cè)的鼻黏膜組織，一部分組織立即經(jīng)甲醛固定，按常規(guī)步驟制片并進行HE染色，用以觀察鼻黏膜組織病理學(xué)變化，另一部分置－80℃保存，用以測定組胺含量。

1.6 病理標本及切片制作方法 病理標本按常規(guī)組織制片技術(shù)制片，HE染色［4］。

1.7 血清中IgE含量測定方法 采用ELISA法檢測血清中IgE含量，詳細步驟見說明書及有關(guān)文獻［5］。

1.8 鼻黏膜組織中組胺測定方法 采用熒光分光光度法檢測組胺含量［6］。

2 結(jié)果

2.1 豚鼠臨床評分變化 致敏7 d后，模型組及治療組每只動物出現(xiàn)典型的AR癥狀，其臨床評分均超過5分，說明造模成功。正常對照組僅少數(shù)動物出現(xiàn)輕抓鼻。治療組從第8天給藥開始至第21天給藥結(jié)束，其臨床評分逐漸出現(xiàn)明顯下降，即隨著治療時間的延長，癥狀明顯緩解(表1)。

2.2 豚鼠噴嚏數(shù)量變化 噴嚏系A(chǔ)R的典型癥狀之一。隨著致敏時間的延長，模型組及治療組豚鼠的噴嚏數(shù)明顯增加，從第8天開始，治療組給予治療藥物后，噴嚏數(shù)逐漸明顯減少，癥狀明顯緩解。而在實驗期間，正常對照組動物幾無噴嚏。

2.3 豚鼠鼻黏膜組織病理學(xué)改變 光鏡下可見:模型組鼻黏膜損傷較嚴重，表現(xiàn)為部分黏膜上皮脫落，固有層血管擴張充血，組織水腫，伴嗜酸性粒細胞及其他炎癥細胞浸潤;空白對照組黏膜上皮呈柱狀排列，未見炎癥細胞浸潤;治療組鼻黏膜損傷較輕，僅見少量嗜酸性粒細胞浸潤(圖1)。

2.4 豚鼠血清中IgE含量變化 模型組血清IgE含量(1.46μg/ml)較高，正常對照組血清IgE含量(1.25μg/ml)較低，治療組血清IgE含量(1.41μg/ml)較模型組為低，與模型組比較，P＜0.05。

2.5 豚鼠鼻黏膜組胺含量變化 正常對照組鼻黏膜組織組胺平均含量(3.02 ng/mg)較低，模型組(4.76 ng/mg)較高，治療組(3.51 ng/mg)較模型組為低，與模型組比較，P＜0.05。

表1 各組動物的臨床評分動態(tài)結(jié)果

3 討論

選擇并建立合適的AR動物模型，對于AR治療藥物藥效學(xué)的研究具有十分重要的意義，其他有關(guān)AR的研究內(nèi)容，如病因?qū)W、發(fā)病機制、預(yù)后等，也都離不開成功的動物模型。本實驗建立TDI誘導(dǎo)的AR豚鼠模型，是目前國際上公認的模型之一［7］。此外，卵白蛋白和日本雪松花粉誘導(dǎo)的AR動物模型亦常被選用。但與后兩者相比，本研究的模型具有周期短、操作簡單、經(jīng)濟、容易成功等優(yōu)點。關(guān)于建模動物，文獻報道較多。有報道表明豚鼠最適于AR模型的建立，被廣泛應(yīng)用于病理機制、新藥研究等［8-9］。品系方面，Dunken Hartley品系使用最為廣泛［10］。

結(jié)合本研究前期預(yù)實驗結(jié)果，提示選擇豚鼠進行AR模型制作時應(yīng)注意以下問題:動物級別和品系最好選擇SPF級Dunken Hartley品系豚鼠，體重達到400 g以上;動物飼養(yǎng)條件要求在SPF級動物房飼養(yǎng)，嚴格保持恒定的溫度和濕度，環(huán)境應(yīng)整潔安靜。否則，動物容易死亡。我們第一次預(yù)實驗結(jié)束時，10只豚鼠僅存3只;第二次預(yù)實驗結(jié)束時，20只豚鼠僅存11只。分析原因:兩次預(yù)實驗選用的豚鼠為清潔級，體重在250～300 g之間;且飼養(yǎng)條件達不到SPF級;建模試劑TDI屬有毒有機化合物，而且其劑量為每側(cè)鼻孔14.5μl/kg，對豚鼠損傷大。因此正式實驗中選擇了SPF級豚鼠，飼養(yǎng)在SPF級動物房，并將TDI劑量調(diào)整為每側(cè)鼻12.5μl/kg。許多文獻報道TDI劑量為每側(cè)鼻5μl/kg，在實驗中發(fā)現(xiàn)隨著動物體重的增長，5μl/kg的劑量激發(fā)動物表現(xiàn)的癥狀并不明顯。經(jīng)實踐證明，12.5μl/kg劑量使動物模型癥狀明顯而又不致死亡。

目前，國際上評價AR的藥效學(xué)指標主要包括:臨床癥狀評分，噴嚏數(shù)，鼻癢次數(shù)，血清IgE含量，鼻黏膜組織病理學(xué)變化，鼻黏膜組胺含量，血管滲透性，鼻充血等［11］。本研究采用其中5個指標用于評價AR模型，以保證模型的可靠性。

圖1 各組動物鼻黏膜病理學(xué)改變(HE×200)

實驗所選擇的布地奈德鼻噴霧劑，是目前治療AR的一線藥物［12］，結(jié)果表明其能有效地緩解豚鼠變應(yīng)性鼻炎的鼻癥狀，改善鼻黏膜組織病理學(xué)的損傷，抑制血中IgE和鼻黏膜中組胺的生成，阻止局部嗜酸性粒細胞的浸潤等。而實驗?zāi)Ｐ蛯λ幬锏闹委煼磻?yīng)明確，亦證實TDI誘發(fā)的豚鼠模型可較大程度地反映人類AR的發(fā)病特點，方法簡便易行且成功率高，為今后開展AR防治藥物的藥效學(xué)研究奠定了良好的基礎(chǔ)。

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