TaqMan-MGB探針對(duì)HCV基因的檢測及分型研究

林秀蓉，陳巧繪，林 海

(本文編輯:張仲書; 英文編輯:王建東)

慢性丙型肝炎10年內(nèi)約有20%發(fā)展成肝硬化，而肝硬化患者每年約3%發(fā)展為肝細(xì)胞癌，因此丙型肝炎的快速分型與診斷是臨床科學(xué)治療的前提和基礎(chǔ)［1］。丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)屬黃熱病毒科，為單股正鏈RNA病毒，約9600個(gè)核苷酸，具有高度多態(tài)性和變異性，根據(jù)基因序列的同源性可分為不同的型和亞型［2］。Simmonds提出并根據(jù)HCV的5'-NCR區(qū)序列的差異，建立了HCV基因組序列的分型方法，將HCV分為6種基因型和30幾種亞型［3］。在此分型方法的基礎(chǔ)上，目前已報(bào)道的基因型有11個(gè)，亞型超過70種。我國主要以基因型1b為主，2a次之，3b在華南和西南地區(qū)流行，6a主要流行于港澳地區(qū)［4-5］。本研究針對(duì)國內(nèi)檢測較多的3種基因型分別設(shè)計(jì)TaqMan-MGB探針，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，再利用探針進(jìn)行分型，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 2010年8月至12月收集來自福建某醫(yī)院HCV-RNA陽性血清40例，其中男24例，女16例，年齡15～65歲，靜脈采血4 ml于30 min內(nèi)分離血清，－20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器和試劑

1.2.1 主要儀器 ABI公司7500型 realtime-PCR儀，TGL-16G低溫高速離心機(jī)，新加坡ESCO 4A-4A1生物安全柜。

1.2.2 主要試劑 HCV-RNA定量試劑盒購于南京馮陽生物技術(shù)公司，SuperScriptTMⅢ第一鏈合成試劑盒、RT-PCR試劑盒購于Invitrogen公司，探針及反應(yīng)預(yù)混液購于上海基康公司。

1.2.3 探針及引物序列 對(duì)從美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)下載的HCV基因序進(jìn)行比較和篩選，用Express 2.0設(shè)計(jì)基因探針(表1)。

1.3 方法 針對(duì)三型常見的丙型肝炎基因型，分別設(shè)計(jì) TaqMan探針，在探針的 5'分別標(biāo)記 FAM(FAM-1b，F(xiàn)AM-3b)、VIC(VIC-2a)，3'標(biāo)記萃滅基因TAMARA和MGB基因。檢測時(shí)每一個(gè)樣品分兩管進(jìn)行，第一管加入FAM-1b和VIC-2a，第二管加入FAM-3 b和VIC-2a，將VIC設(shè)置為綠色，F(xiàn)AM-1 b設(shè)置為紅色，F(xiàn)AM-3b設(shè)置為棕色，擴(kuò)增結(jié)束后，根據(jù)讀取的擴(kuò)增曲線快速分型(圖1)。

表1 試驗(yàn)所涉及的引物及MGB探針(探針1-3分別對(duì)應(yīng)于1b、2a和3b基因)

圖1 TaqMan-MGB探針檢測HCV基因示意圖

1.3.1 總RNA的提取 將200μl血液樣本放入離心管，在離心管中加入800μl Trizol，室溫混勻，放置5 min;加入200μl氯仿劇烈振蕩15 s，室溫放置2 min;4℃ 12000 r/min(離心半徑8 cm，下同)離心15 min;仔細(xì)吸取上層水相到另一離心管中，加入500μl異丙醇，輕輕混勻后室溫靜置10 min;4℃12000 r/min離心10 min，棄上清;加入75%乙醇1 ml，充分洗滌沉淀;4℃ 7500 r/min離心5 min，棄上清，潔凈工作臺(tái)內(nèi)吹風(fēng)至沉淀干燥;將沉淀溶于10 μl DEPC處理的水中，立即進(jìn)入cDNA第一鏈的合成。

1.3.2 cDNA第一鏈合成 反應(yīng)體積20μl，其中10 mM dNTP 1 μl，10 pmol引物 Oligo(dT)1 μl，總 RNA 2 μl，RNA 酶抑制劑1 μl(40 U/μl)，SuperScriptTMⅢ0.5 μl(200 U/μl)，按以下條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng):95℃ 3 min，迅速置于冰浴中 2 min;42℃，90 min，70℃，15 min，37℃ 加入 RNAaseH(2 U/μl)1μl，孵育 20 min，4℃保存。

1.3.3 反應(yīng)體系設(shè)計(jì)及檢測 為了既節(jié)約又能檢測目的序列，我們設(shè)計(jì)了雙管法來檢測HCV基因，探針Prob1、Prob2和引物F及R組成一組，用來檢測1b和2a;探針Prob2和探針Prob3及引物F、R組成一組，用來檢測2a和3b。反應(yīng)在Stedp one realtime PCR儀中進(jìn)行，反應(yīng)設(shè)置為:50℃預(yù)變性2min，95℃始變性 10 min，95℃退火 10 s，60℃延伸 40 s，40個(gè)循環(huán)，每一次循環(huán)結(jié)束檢測熒光，全部反應(yīng)結(jié)束后檢測熒光判讀基因分型。

2 結(jié)果

利用熒光定量PCR TaqMan-MGB擴(kuò)增建立的檢測方案，對(duì)40個(gè)樣本進(jìn)行了檢測。根據(jù)擴(kuò)增曲線，可以方便快速地檢測出大部分樣本的基因型(圖2)，共有39個(gè)樣品被檢出，檢出率97.5%。其中，1b型29 例，占74.36%;2a型5 例，占12.82%;3b型6 例，占13.38%。

3 討論

圖2 擴(kuò)增結(jié)果

HCV是一種經(jīng)血液傳播引起的慢性肝臟疾病的RNA病毒，其核酸是單股線性，正鏈RNA長約9.4 kbp。由于病毒缺乏RNA復(fù)制酶亦缺乏校正功能，復(fù)制時(shí)易引起基因突變，因此HCV病毒呈現(xiàn)高度異質(zhì)性，不同地區(qū)、不同人群甚至不同個(gè)體分離到的病毒株基因組均不同。根據(jù)基因序列差異，目前HCV主要被劃分為6個(gè)基因型，不同基因型的分布有地區(qū)差異。

我國大陸地區(qū)HCV基因型主要為1型，其次為2型，香港地區(qū)還有6型，其分布呈南北差異，南方以1型為主，北方2型逐漸增多［7］。郝飛等［6］報(bào)道，我國大陸地區(qū)1b型占80%，與本研究結(jié)果大致相當(dāng)。但是近年由于人口流動(dòng)增加，HCV的地域分布也有所變化，福建為沿海地區(qū)，對(duì)外交流多，人口流動(dòng)快，人群中HCV基因型呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化，而不同的基因型對(duì)治療的反應(yīng)性不同。對(duì)丙型肝炎患者進(jìn)行快速準(zhǔn)確的分型是醫(yī)治的前提和基礎(chǔ)，準(zhǔn)確的分型方法有助于提高丙型肝炎的醫(yī)治水平［8］。

丙型肝炎的診斷，除癥狀體征及肝功能檢查以外，主要是靠血清病毒學(xué)的實(shí)驗(yàn)室檢測，而抗-HCV陽性是臨床診斷的重要依據(jù)，根據(jù)丙型肝炎的基因分型，較具有說服力和實(shí)用價(jià)值?；蚍中偷姆椒ê芏啵袦y序法、酶切分型等［9-10］，TaqMan法是近年來應(yīng)用較多的一種基因分型方法，其優(yōu)點(diǎn)是檢測的特異性較高，但是也有不足之處，比如專用試劑合成價(jià)格比較高、需要專業(yè)的公司合成等［11］。本研究使用的TaqMan-MGB探針基因分型方法，探針設(shè)計(jì)合理，靈敏度和特異性均較高，值得推廣。

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