鵝細小病毒P C R檢測方法的建立及初步應用

王 倩，鞠環(huán)宇，荊志強，李彥偉，王春媛，馬 波，王君偉

（東北農業(yè)大學動物醫(yī)學學院，哈爾濱 150030）

鵝細小病毒（Goose parvovirus，GPV）病是一種主要侵害雛鵝和雛番鴨的急性、亞急性、高度接觸性傳染病，其傳染性強，死亡率高，部分病例在病鵝小腸段出現(xiàn)“香腸”狀栓，是目前危害養(yǎng)鵝業(yè)的主要傳染病之一[1]。一般認為，小鵝瘟根據(jù)流行病學、臨床特征和剖檢特點，可以做出初步診斷，但是，最急性型小鵝瘟、小鵝流感、鵝病毒性腸炎以及近年來新發(fā)現(xiàn)的鵝副粘病毒病等疾病均具有相似的臨床和剖檢特征[2-3]。為此，開展小鵝瘟的實驗室診斷研究具有重要意義。

目前已建立了許多檢測小鵝瘟病原的方法，如病毒分離試驗、ELISA[4]、Dot-ELISA[5]、反向間接血凝抑制試驗[6]、中和試驗、核酸探針[7]等，其中ELISA對人員和試劑的要求較高，且需要特異性抗體，病毒分離和中和試驗耗時較長，且鵝胚的不均一性對試驗結果影響較大，總之這些方法在臨床應用上都沒有達到較滿意的效果。PCR作為一種新的分子生物學實驗技術，在疾病診斷中發(fā)揮著越來越重要的作用，該方法具有靈敏度高、快速特異、操作簡便等優(yōu)點。布日額[8]、姚笛[9]、劉家森[10]等建立了檢測小鵝瘟的單重PCR方法，趙研[11]等建立了二重PCR方法，程安春建立了實時熒光定量PCR方法以及尚毅建立了LAMP方法，但這些方法都是以一株GPV為參考序列的[12-13]。本試驗以NCBI上公布的7株為參考序列，旨在建立一種能夠檢測病料組織中所有GPV的特異性PCR方法，為臨床診斷GPV感染和探索各組織器官中GPV的分布規(guī)律提供有效手段。

1 材料與方法

1.1 毒株和菌株

GPV-98E（毒價為 105.15ELD50/0.2 mL）、GPMV由本實驗室保存，AIV-H5由中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所田國彬副研究員惠贈，DPV購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；感受態(tài)細胞TG1由本實驗室制備。

1.2 儀器

PCR儀：Eppendorf公司；離心機5418型：Eppendorf公司；電泳儀Savant PS4000型：Promega公司產品；凝膠成像儀：Alpha Innotech Corporation產品；DK-8D型電熱恒溫水槽：上海一恒科技有限公司產品。

1.3 試劑

蛋白酶K（購自Merck公司）；十二烷基磺酸鈉（SDS）（購自Amresco公司）；DNA Marker（購自北京全式金公司）；PCR試劑、pMD18-T載體、鼠源反轉錄酶（M-MLVRT）（購自寶生物工程（大連）有限公司）；組織/細胞總RNA快速抽提試劑盒（購自哈爾濱?；锟萍加邢薰荆?；多功能DNA純化回收試劑盒（購自北京百泰克生物技術有限公司）；其他試劑均為分析純。

1.4 引物

1.4.1 GPV引物設計

根據(jù)Genbank發(fā)表的7株GPV的全序列，在相對保守的NS區(qū)設計了一對引物，引物完全落在7個全序列的保守區(qū)，引物之間為變異區(qū)。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 GPV-NS基因所需引物Table1 Primers for amplifying GPV-NS gene

1.4.2 DPV、AIV和GPMV特異性引物

實驗室保存。

表2 特異性試驗所需引物Table2 Primers for specificity assay

1.5 病毒核酸的提取

1.5.1 GPV和DPV DNA的提取

取尿囊液425 μL，加入蛋白酶K（10 mg·mL-1）25 μL，10%SDS 50 μL，56 ℃水浴1 h，分別用酚/氯仿/異戊醇、氯仿各抽提一次，取上清加入1/10終體積的NaAc（3 mol·L-1，pH 5.2）和2倍體積的無水乙醇沉淀DNA，70%乙醇洗滌一次，干燥后溶于20 μL滅菌去離子水中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 AIV和GPMV RNA的提取

參考試劑盒說明書進行。

1.6 反轉錄合成cDNA

以AIV和GPMV基因組RNA為模板，分別以GMs和AIV通用下游引物作為反轉錄引物，反轉錄體系為25 μL，過程如下：RNA模板11.0 μL，引物（50 pmol·μL-1）2.0 μL，70 ℃水浴 5 min，冰浴5 min，再加入 5×M-MLVRT Buffer 5.0 μL，dNTP（2.5 mmol·L-1）5.0 μL，RNAase抑制劑 1.0 μL，鼠源反轉錄酶（M-MLVRT）1.0 μL，42 ℃水浴 90 min，70℃水浴15 min，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 PCR擴增及產物檢測

反應體系 25 μL：10×PCR Buffer 2.5 μL，2.5 mmol·L-1dNTP 2.0 μL，上下游引物（10 pmol·μL-1）各0.5 μL，模板1.0 μL，5 U·μL-1rTaq 0.2 μL，滅菌去離子水補足。反應條件：95℃預變性5 min；94℃變性30 s，55.2℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán)；72℃終延伸7 min，4℃終止反應。

取5 μL PCR產物與1 μL上樣緩沖液混勻，以95 V恒定電壓在0.8%瓊脂糖凝膠中電泳15 min，以Trans 2K plusⅡ分析并掃描記錄結果。

1.8 PCR產物的純化、克隆及序列測定

將PCR產物在0.8%瓊脂糖凝膠上進行電泳，切下目的條帶按多功能DNA純化回收試劑盒的使用說明回收目的DNA，將純化的目的DNA 4.5 μL、pMD18-T載體0.5 μL和SolutionⅠ5 μL混勻，16℃連接過夜，轉化TG1感受態(tài)細胞，挑取白色菌落接種含終濃度為50 μg·mL-1Amp+的5 mL LB液體培養(yǎng)基，37℃搖振培養(yǎng)12 h，經(jīng)堿裂解法提取質粒，Bam HⅠ/HindⅢ雙切鑒定為陽性質粒，送往上海生工測序。

1.9 PCR的敏感性試驗

將原倍尿囊液用生理鹽水做10倍倍比稀釋（100～10-8），提取核酸后，用已建立的PCR方法進行擴增，以確定其敏感性。將提好的DNA測核酸濃度，用生理鹽水做10倍倍比稀釋，用已建立的PCR方法進行擴增，以確定其最小檢出量。

1.10 PCR的特異性試驗

用GPV-NS引物同時對GPV、DPV和AIV、GPMV的cDNA進行PCR擴增。

1.11 重復性試驗

以上試驗在相同的條件下重復3次以上，以驗證結果的可靠性。

1.12 適應性試驗

在不同地理位置對已知樣品進行PCR檢測，以驗證此方法的可靠性。

1.13 臨床應用

利用本試驗所建立的PCR方法檢測52份雛鵝病料，包括心、肝、腸等。具體步驟如下：將病料放于安瓶中，加3倍體積的PBS，用小剪子剪碎，轉移到研磨器中研磨，上清轉移到1.5 mL離心管中，反復凍融3次，離心取上清，按1.5.1步驟進行。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增結果

PCR產物與DNA Marker比較，證實GPV DNA擴增大小為476 bp，與預期大小相符。

圖1 PCR擴增PCV2-ORF2基因Fig.1 Result of PCR product

2.2 序列測定

結果表明克隆得到GPV-NS基因特異性引物擴增片段基因序列全長476 bp，與7株參考毒株相應區(qū)域相似性為98.42%。

2.3 PCR的敏感性試驗

結果表明將尿囊液作105倍稀釋，即0.2 mL含有100.15個ELD50，其最低能檢出0.15個ELD50。

核酸濃度＝OD260×50×稀釋倍數(shù)/1 000＝0.4196 μg·μL-1，最小檢出4.194 pg核酸。

2.4 PCR的特異性試驗

用NS引物同時對GPV和已知對照病毒的核酸進行擴增，除GPV核酸，其他均未擴增出任何條帶，而對照病毒均已擴增出已知大小的特異性目的條帶（特異性引物見表2）。

各特異性條帶均已測序，與參考序列的同源性均高于94%以上。

圖2 GPV-NS基因片段序列Fig.2 Sequence of GPV-NS gene

圖3 敏感性試驗結果Fig.3 Sensitive result of PCR detection

圖4 核酸最低檢出限量Fig.4 Result of minimum detectability of nucleinic acid

2.5 重復性試驗

相同條件下重復以上試驗3次，結果均一致。

圖5 特異性試驗結果Fig.5 Specific result of PCR detection

2.6 適應性試驗

在3個不同實驗室采用該方法對已知陰陽性樣品進行PCR擴增，結果與預期一致，表明其適應性良好。

2.7 臨床應用

應用建立的PCR方法檢測了52份臨床感染的雛鵝病料，包括自然感染的17份和人工感染的35份，其中有50份陽性，其陽性檢出率為96.2%，2份陰性為人工感染，證實此PCR方法能夠直接檢測多種臨床病料中的鵝細小病毒的DNA，能初步用于臨床應用。

3 討論與結論

我國是世界養(yǎng)鵝第一大國，隨著養(yǎng)鵝業(yè)的發(fā)展，鵝病也出現(xiàn)逐步增多的趨勢，而小鵝瘟是危害養(yǎng)鵝業(yè)最嚴重的傳染病之一。為了能更加有效地防治該病，采用新型快速診斷方法是控制該病行之有效的途徑之一。目前小鵝瘟實驗室診斷方法主要有病毒分離、瓊擴試驗和酶聯(lián)免疫吸附試驗等，這些方法特異性不高、耗時長，不能針對病原做出快速特異的診斷。國內外有許多學者建立了用于檢測GPV的PCR方法[8-14]，本試驗建立的PCR方法具有特異性強、敏感性高、快速簡便等特點，相信能在臨床診斷中能有良好的應用前景。

在基因選擇方面，本試驗根據(jù)GenBank中7株GPV的全序列，選取了高度保守的NS區(qū)625～1 125 nt，以此設計了一對引物，以期能檢測所有的GPV，測序結果也證實了這一點，不僅與7株全序列具有高度同源性，也與未公布全序列的NS區(qū)具有高度的同源性。

在摸索PCR最佳反應條件時發(fā)現(xiàn)本試驗所用的檢測引物在退火溫度52～56℃均能較特異地擴增出目的條帶，最終選擇55.2℃為退火溫度。此PCR方法可最低檢測到0.15個ELD50和4.194 pg的核酸，可在病毒的毒力和毒量之間的關系上做個橫向的參考。利用此對引物對已知DPV、AIV、GPMV的核酸進行擴增，結果均為陰性，表明此方法具有較高的特異性。

本試驗從樣品處理到完成整個檢測過程大約需8 h，比常規(guī)的病毒分離方法的時間縮短了很多。本試驗中應用建立的PCR方法檢測了52份雛鵝病料，其中50份陽性，2份陰性屬于人工感染病料，其原因可能是雛鵝本身體質較弱而病毒未達到臟器所致。在人工感染的病料中，在同一雛鵝上，心和肝都能檢出，而腸偶爾檢測不出，這可以為日后GPV檢測病料選取上提供依據(jù)。該方法用于臨床還有一定的距離，還需在大量臨床樣品檢測中進行實踐和摸索。

本研究是為了鵝細小病毒PCR檢測試劑盒的研制奠定基礎的，所以以上試驗均按照農業(yè)部制定的《獸用診斷制品試驗研究技術指導原則》所規(guī)定的主要技術指標實施的，但限于鵝胚的季節(jié)性，敏感性和特異性的部分試驗尚未完成，將在后期繼續(xù)完善。

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