蕨菜孢子組織培養(yǎng)技術(shù)的研究1）

郭宇蘭，陳宇

（黑龍江省林副特產(chǎn)研究所，黑龍江省非木質(zhì)林產(chǎn)品研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 牡丹江157011）

蕨菜〔Pteridium aquilinum （L.）Kuhn.〕，又叫拳菜、蕨兒菜、拳頭菜、龍須菜、龍頭菜、如意菜等，屬鳳尾蕨科多年生植物，多野生于陰濕淺山荒坡、半山坡及林下草地?？晒┦秤没蜥勗?，有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。蕨菜因其風(fēng)味獨(dú)特，營(yíng)養(yǎng)豐富而為人們所喜食。近年來(lái)，食用綠色食品極為風(fēng)行，而蕨菜因其生長(zhǎng)在無(wú)污染的環(huán)境中，是極其優(yōu)良的綠色食品品種，因而深受?chē)?guó)際市場(chǎng)的歡迎。由于對(duì)野生蕨菜的過(guò)度采集和人為活動(dòng)對(duì)其生存環(huán)境的破壞，其產(chǎn)量逐年下降，人工種植蕨菜已經(jīng)引起人們廣泛關(guān)注，保護(hù)蕨菜資源，發(fā)展人工栽培技術(shù)顯得十分必要。通常利用地下莖進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)繁殖，繁殖系數(shù)低，工作強(qiáng)度大，難以進(jìn)行大面積推廣。利用組織培養(yǎng)技術(shù)快繁種苗是滿足蕨菜生產(chǎn)的關(guān)鍵。該研究利用蕨菜孢子培養(yǎng)，成功獲得大量的組培生根苗，且移栽成活率較高。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

來(lái)源于黑龍江省林副特產(chǎn)研究所采摘的蕨菜孢子，采自2012年6月黑龍江省林副特產(chǎn)研究所實(shí)驗(yàn)地，收集好后，放置4℃冰箱保藏。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 無(wú)菌外植體的準(zhǔn)備

將采集的蕨菜孢子用無(wú)菌濾紙包好，曲別針固定封口。將紙包置于75%的酒精中消毒30s，無(wú)菌蒸餾水清洗2次，再用0.1%的HgCl2消毒，設(shè)置60s、120s、150s、180s消毒處理，無(wú)菌水清洗洗4～5次，然后用滴管吸取孢子溶液，滴于MS培養(yǎng)基中。每個(gè)處理20瓶，3次重復(fù)，3d后開(kāi)始調(diào)查污染率，之后每早調(diào)查1次，10d后結(jié)束調(diào)查。

1.2.2 培養(yǎng)條件

本實(shí)驗(yàn)采用MS為基本培養(yǎng)基，附加2%蔗糖，0.5%瓊脂，pH5.8～6.0，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑在滅菌前加入。培養(yǎng)基在121℃高壓滅菌鍋中滅菌30min。培養(yǎng)室溫度控制在（25±2）℃，光強(qiáng)為2500～3000 lx，光周期為光培養(yǎng)16h，暗培養(yǎng)8h。

1.2.3 誘導(dǎo)培養(yǎng)

將外植體接種于 MS、1／2MS、1／4MS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件同上，每個(gè)處理20瓶，9次重復(fù)。7d天后開(kāi)始觀察和調(diào)查原葉體的生長(zhǎng)情況。

1.2.3 增殖培養(yǎng)

將D 0.5cm原葉體接種到不同附加物的8組培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同上，觀察培養(yǎng)物分化狀況。每個(gè)處理20瓶，9次重復(fù)。7d天后開(kāi)始觀察并記錄生長(zhǎng)狀況。

1.2.4 生根誘導(dǎo)

繼代增殖培養(yǎng)后，當(dāng)試管苗長(zhǎng)度有85%以上超過(guò)2cm時(shí)，取生長(zhǎng)旺盛的試管苗進(jìn)行生根培養(yǎng)，生根培養(yǎng)基為1／2MS＋NAA（0～0.1）mg／L＋I(xiàn)BA（0.1～0.2）mg／L。長(zhǎng)度過(guò)小的轉(zhuǎn)接到繼代培養(yǎng)基上繼續(xù)進(jìn)行擴(kuò)繁培養(yǎng)，以提高材料的利用率。每種處理20瓶，重復(fù)9次，30d后統(tǒng)計(jì)生根率、根長(zhǎng)。

1.2.5 練苗與移栽

當(dāng)根長(zhǎng)4～6cm左右，生長(zhǎng)健壯時(shí)進(jìn)行馴化移栽。首先在培養(yǎng)室打開(kāi)瓶蓋放置5d，然后用鑷子從瓶?jī)?nèi)取出植株，用自來(lái)水沖洗凈附著在根部的培養(yǎng)基，移栽到營(yíng)養(yǎng)缽中（土∶沙∶腐熟土有機(jī)肥＝1∶1∶0.5），套袋保濕，大約一周后，長(zhǎng)出新葉，可以去掉遮蓋，放到溫室進(jìn)行管理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒時(shí)間對(duì)外植體成活率的影響

表1 不同消毒時(shí)間對(duì)蕨菜孢子成活率的影響

表1結(jié)果表明，隨著升汞消毒時(shí)間的增加，污染率降低，但雖然升汞的消毒效果很有效，卻對(duì)外植體的活化和分化等方面產(chǎn)生了一定的影響。由表1可看出：70%的酒精處理30s后，再用0.1%HgCl2處理150s最合適蕨菜孢子消毒。

2.2 不同濃度無(wú)機(jī)鹽對(duì)孢子萌發(fā)及原葉體形成的影響

1周后顯微鏡下可觀察到孢子大量萌發(fā)，并逐漸形成絲狀體和片狀體，1個(gè)月后可形成D 0.4cm左右的原葉體。

表2 不同無(wú)機(jī)鹽濃度下的孢子萌發(fā)情況

由表2可知，蕨菜孢子萌發(fā)與無(wú)機(jī)鹽濃度高低有關(guān)，濃度高時(shí)抑制孢子萌發(fā)，而濃度過(guò)低則不利于孢子萌發(fā)。適當(dāng)?shù)臒o(wú)機(jī)鹽濃度則有助于孢子萌發(fā)及原葉體形成。

2.3 不同激素水平對(duì)原葉體增殖的影響

將原葉體分切成0.5cm的原葉體小塊接種到1／2MS＋6－BA（0.5～2.0）mg／L＋NAA（0.05～0.1）mg／L的培養(yǎng)基中，2個(gè)月后統(tǒng)計(jì)增殖情況。

表3 不同激素水平對(duì)原葉體增殖的影響

根據(jù)增殖質(zhì)量和數(shù)量來(lái)評(píng)價(jià)激素配比的狀態(tài)，從而選出最佳激素配比的培養(yǎng)基。由表3可以看出，3號(hào)培養(yǎng)基最合適原葉體的增殖培養(yǎng)。

2.4 不同濃度的生長(zhǎng)素對(duì)壯苗生根的影響

表3 不同濃度的IBA與NAA組合對(duì)試管苗生根的影響

由表3可以看出，試驗(yàn)蕨菜孢子苗生根培養(yǎng)是以1／2MS為基本培養(yǎng)基，在9種培養(yǎng)基中，小苗均能生根，生根率在5號(hào)培養(yǎng)基中最高，達(dá)98.6%，生根最快，根系發(fā)達(dá)、粗壯，且組培苗生長(zhǎng)良好，葉片濃綠，小苗長(zhǎng)勢(shì)較為旺盛，均長(zhǎng)有4條以上長(zhǎng)度超過(guò)7cm的根，且健壯，此時(shí)即可出瓶移栽。

2.3 試管苗移栽

當(dāng)根長(zhǎng)2～3cm時(shí)進(jìn)行馴化移栽。首先在培養(yǎng)室將打開(kāi)瓶蓋放置一周，然后用鑷子從瓶?jī)?nèi)小心取出植株，出瓶時(shí)要小心不要傷到根，用自來(lái)水沖洗凈附著在根上的培養(yǎng)基，陰涼處晾干表面水分。移栽到營(yíng)養(yǎng)缽中（土∶沙∶腐熟土有機(jī)肥＝1∶1∶0.5），套袋保濕，第1次澆足水后，1周內(nèi)不澆水，經(jīng)常向小盆周?chē)牡厣蠟⑺?，保持空氣濕?0%～90%，通風(fēng)，大約一周后，長(zhǎng)出新葉，可以去掉遮蓋，放到溫室進(jìn)行管理，成活率可達(dá)95%以上。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)用無(wú)菌濾紙打包的方法進(jìn)行孢子滅菌，操作簡(jiǎn)單，節(jié)省時(shí)間。試驗(yàn)表明，蕨菜孢子的適宜滅菌方法為：用70%酒精滅菌30s，無(wú)菌蒸餾水清洗2次，再用0.1%的HgCl2消毒150s，無(wú)菌水清洗洗4～5次。增殖培養(yǎng)基為1／2MS＋6－BA1.5mg／L＋NAA 0.05mg／L。生根培養(yǎng)基為1／2MS＋NAA 0.05mg／L＋I(xiàn)BA0.2mg／L，生根率可達(dá)98.6%，均長(zhǎng)有4條以上長(zhǎng)度超過(guò)7cm的根。將長(zhǎng)勢(shì)佳的試管苗進(jìn)行移栽，成活率可達(dá)95%。