實(shí)驗(yàn)性高脂血癥恒河猴模型的初步建立及分析

楊鳳梅，李艷艷，魯帥堯，趙 遠(yuǎn)，禹文海，陳麗雄，王俊斌，和占龍

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650118)

實(shí)驗(yàn)性高脂血癥恒河猴模型的初步建立及分析

楊鳳梅，李艷艷，魯帥堯，趙 遠(yuǎn)，禹文海，陳麗雄，王俊斌，和占龍

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650118)

目的 建立實(shí)驗(yàn)性高脂血癥恒河猴模型，為人類高脂血癥研究提供理想動(dòng)物模型。方法 設(shè)計(jì)高脂實(shí)驗(yàn)飼料配方并檢測(cè)常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分，用高脂飼料誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性高脂血癥恒河猴模型，分別在2個(gè)月、4個(gè)月、6個(gè)月后監(jiān)測(cè)體重、血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL－C)、低密度脂蛋白(LDL－C)等指標(biāo)，對(duì)其血脂指標(biāo)的變化趨勢(shì)進(jìn)行分析。結(jié)果 模型組在實(shí)驗(yàn)2個(gè)月、4個(gè)月時(shí)的日采食量和攝入能量均低于對(duì)照組(P＜0.05)，但體重則無(wú)明顯變化(P＞0.05);而在實(shí)驗(yàn)6個(gè)月時(shí)日采食量和攝入能量與對(duì)照組無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，體重有顯著性差異(P＜0.05);模型組與對(duì)照組的 TC、TG、HDL－C、LDL－C在實(shí)驗(yàn)前和2個(gè)月比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05);在4個(gè)月比較時(shí)TC、TG、LDL－C有顯著性差異(P＜0.05)，而HDL無(wú)顯著性差異(P＞0.05);在6個(gè)月比較時(shí) TC、LDL－C有顯著性差異(P＜0.05)，并且 TC、LDL－C遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于恒河猴血脂的正常參考值水平，而 TG、HDL－C則無(wú)顯著性差異(P＞0.05);變化趨勢(shì)分析結(jié)果為，模型組 TC和 LDL－C水平有遞增趨勢(shì)、TG水平則出現(xiàn)了先遞減后逐漸恢復(fù)的趨勢(shì)、HDL－C水平未出現(xiàn)明顯變化趨勢(shì)。結(jié)論 模型組恒河猴具有高膽固醇血癥和高低密度脂蛋白血癥的特征，已經(jīng)初步建立了實(shí)驗(yàn)性恒河猴高脂血癥動(dòng)物模型。

血脂;高脂血癥;模型，動(dòng)物;恒河猴

隨著人類生活水平的日益提高，高脂血癥的發(fā)病率也逐年增加，相關(guān)的醫(yī)學(xué)研究表明動(dòng)脈粥樣硬化是導(dǎo)致心腦血管疾病的主要病理因素，而血脂代謝紊亂導(dǎo)致的高脂血癥又是動(dòng)脈粥樣硬化重要的危險(xiǎn)因素，可見(jiàn)高脂血癥是腦卒中、冠心病、心肌梗死、猝死等心腦血管疾病的危險(xiǎn)因素。因此，闡明高脂血癥的發(fā)病機(jī)制，探索高脂血癥的有效預(yù)防與治療對(duì)其相關(guān)疾病的研究和控制具有重要意義。高脂血癥動(dòng)物模型不僅是研究人類高脂血癥發(fā)病機(jī)理的有效工具，也是開(kāi)展脂代謝異常及動(dòng)脈粥樣硬化研究的重要的手段。目前，用于高脂血癥動(dòng)物模型研究的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物主要有兔、大鼠、小鼠等，采用與人類遺傳和生理生化指標(biāo)都較為接近的恒河猴作為模型的在國(guó)內(nèi)還未見(jiàn)報(bào)道［1－4］。因此，本實(shí)驗(yàn)選用恒河猴作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，用高脂飼料飲食誘導(dǎo)方法，初步建立實(shí)驗(yàn)性高脂血癥恒河猴模型并對(duì)其血脂指標(biāo)變化趨勢(shì)進(jìn)行分析，為人類高脂血癥的研究提供理想動(dòng)物模型。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)恒河猴來(lái)源于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所醫(yī)學(xué)靈長(zhǎng)類研究中心，普通級(jí)恒河猴實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(滇)2010－0006;實(shí)驗(yàn)過(guò)程在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施中進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為:SYXK(滇)2010－0009，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道關(guān)懷。

1.2 儀器設(shè)備

移液器 (eppendorf 100 μL)、離心機(jī) (Thermo LEGEND MICRO 21R)、羅氏全自動(dòng)生化分析儀(P800)。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)飼料的設(shè)計(jì)與制作:實(shí)驗(yàn)組模型飼料的設(shè)計(jì)以高脂、高熱量為特點(diǎn)，使用特殊預(yù)混料;因高脂導(dǎo)致飼料較難形成顆粒，通過(guò)特殊的加工工藝制作為顆粒飼料，以正常猴群飼料作為對(duì)照組，配方見(jiàn)表1，兩種飼料的常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分見(jiàn)表2。

1.3.2 動(dòng)物分組及高脂血癥模型的誘導(dǎo):隨機(jī)挑選正常飼養(yǎng)的成年8歲健康恒河猴共16只，分為兩組每組8只，雌雄各半，分別為模型組和對(duì)照組。模型組飼喂模型飼料，對(duì)照組飼喂正常飼料，自由采食與飲水，測(cè)定日采食量和攝入能量，根據(jù)恒河猴體型大、善于運(yùn)動(dòng)、代謝旺盛等生理特點(diǎn)，本次實(shí)驗(yàn)以每?jī)蓚€(gè)月測(cè)定一次體重、血脂等指標(biāo)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

表1 模型飼料與正常飼料的配方(%)Tab.1 Formulation of model feed and natural feed(%)

表2 模型飼料和正常飼料的常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分Tab.2 Seven general nutrients of model feed and natural feed

1.3.3 血清樣品采集:試驗(yàn)動(dòng)物空腹12h以上，進(jìn)行后肢靜脈采血2mL，分裝在一次性自動(dòng)定量采血管中，3000r/min離心 30min，收集血清，標(biāo)記后－20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 血脂檢測(cè):使用羅氏全自動(dòng)生化分析儀(P800)檢測(cè)血清樣品，TC、TG采用氧化酶法測(cè)定，HDL－C、LDL－C 采用直接法測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 模型組和對(duì)照組在實(shí)驗(yàn)期間的日采食量及日攝入能量的測(cè)定結(jié)果(見(jiàn)表3)。測(cè)定結(jié)果表明，在實(shí)驗(yàn)2個(gè)月、4個(gè)月對(duì)照組恒河猴的日采食量和攝入能量均高于模型組(P＜0.05)，這應(yīng)該是高脂飼料適口性較差以及油膩食物限制進(jìn)食量等原因造成的結(jié)果，而在6個(gè)月時(shí)，模型組恒河猴的日采食量和攝入能量與對(duì)照組在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。

表3 恒河猴高脂血癥模型組和對(duì)照組在試驗(yàn)期的日采食量及攝入能量測(cè)定結(jié)果Tab.3 Feed intake and Energy intake of the model group and the control group in experiment

2.2 模型組和對(duì)照組在實(shí)驗(yàn)期間的體重監(jiān)測(cè)結(jié)果(見(jiàn)表4)，體重監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，在實(shí)驗(yàn)前、2個(gè)月、4個(gè)月時(shí)，模型組與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，而在6個(gè)月時(shí)有顯著性差異(P＜0.05)。

表4 恒河猴高脂血癥模型組和對(duì)照組體重監(jiān)測(cè)結(jié)果(kg)Tab.4 Weight of the model group and the control group(kg)

2.3 模型組和對(duì)照組在實(shí)驗(yàn)期間的血脂四項(xiàng)(TC、TG、HDL－C、LDL－C)的監(jiān)測(cè)結(jié)果(見(jiàn)表5)，結(jié)果表明模型組與對(duì)照組的 TC、TG、HDL－C、LDL－C 在實(shí)驗(yàn)前和2個(gè)月比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，在4個(gè)月比較時(shí) TC、TG、LDL－C 有顯著性差異(P ＜0.05)，而HDL－C沒(méi)有顯著性差異(P＞0.05);模型組實(shí)驗(yàn)前和4個(gè)月時(shí)比較 TC、LDL－C呈顯著上升(P＜0.05)，而TG則顯著下降(P＜0.05);在6個(gè)月比較時(shí) TC、LDL－C 有顯著性差異(P ＜0.05)，并且 TC、LDL－C遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于恒河猴血脂的正常參考值水平，而TG、HDL－C 則無(wú)顯著性差異(P ＞0.05)。

表5 恒河猴高脂血癥模型組和對(duì)照組血脂四項(xiàng)監(jiān)測(cè)結(jié)果Tab.5 Four indexes about lipids of the model group and the control group

2.4 血脂各項(xiàng)指標(biāo)的分析結(jié)果表明，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)照組血清 TC、TG、HDL－C、LDL－C 水平均無(wú)明顯變化，模型組TC水平有遞增趨勢(shì)，并在4個(gè)月、6個(gè)月時(shí)顯著增高(P＜0.05)(見(jiàn)圖1)，具備了高膽固醇血癥的特征;而TG水平在模型組則出現(xiàn)了先遞減后逐漸恢復(fù)的趨勢(shì)，在4個(gè)月時(shí)顯著降低(P＜0.05)，在6個(gè)月時(shí)又恢復(fù)(見(jiàn)圖2)，這可能與受試動(dòng)物膽固醇的攝入和日攝入能量的水平有關(guān)，具體機(jī)制尚未清楚;HDL－C水平在模型組未出現(xiàn)明顯變化(見(jiàn)圖3);LDL－C水平在模型組也有遞增趨勢(shì)，并在4個(gè)月、6個(gè)月時(shí)顯著增高(P＜0.05)(見(jiàn)圖4)，提示脂代謝紊亂導(dǎo)致了高脂血癥。

圖1 血清TC變化趨勢(shì)分析Fig.1 Analysis of mutative trend of TC

圖2 血清TG變化趨勢(shì)分析Fig.2 Analysis of mutative trend of TG

圖3 血清 HD{L－C變化趨勢(shì)分析Fig.3 Analysis of mutative trend of HDL－C

圖4 血清LDL－C變化趨勢(shì)分析Fig.4 Analysis of mutative trend of LDL－C

3 討論

恒河猴是與人類在進(jìn)化親緣關(guān)系上僅次于黑猩猩的靈長(zhǎng)類動(dòng)物，具有與人類基因同源性高、免疫反應(yīng)與人相似等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域。因此，本實(shí)驗(yàn)采用恒河猴作為高脂血癥的模型動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)研究中有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)之處。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用高脂飼料誘導(dǎo)高脂血癥動(dòng)恒河猴型的過(guò)程中，在實(shí)驗(yàn)2個(gè)月、4個(gè)月時(shí)模型組的日采食量和日攝入能量均低于對(duì)照組，加之本實(shí)驗(yàn)所采用的實(shí)驗(yàn)猴是生長(zhǎng)和代謝都較為穩(wěn)定的成年猴，導(dǎo)致了試驗(yàn)猴的體重均無(wú)明顯變化，但在實(shí)驗(yàn)6個(gè)月時(shí)，隨著采食量與日攝入量的增加，體重也隨之增加。在實(shí)驗(yàn) 4個(gè)月、6個(gè)月時(shí)模型組血清 TC、LDL－C明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)，并穩(wěn)定維持在一個(gè)較高的水平，而 HDL－C無(wú)明顯變化，這一結(jié)果與趙金明等［6］報(bào)道的觀點(diǎn)相一致;而在4個(gè)月時(shí)血清TG并未升高，反而明顯低于對(duì)照組，這與王靜鳳［7］、劉小美［8］、林衛(wèi)華［9］報(bào)道的結(jié)果一致。造成這些結(jié)果的可能機(jī)制是高脂肪和高TC的攝入使動(dòng)物體內(nèi)血液的 TC含量劇增，出現(xiàn) TC代謝障礙，進(jìn)而引起機(jī)體的血脂代謝紊亂，直接導(dǎo)致LDL－C的代謝障礙并在體內(nèi)蓄積，從而出現(xiàn)了高TC血癥和高LDL－C血癥。而實(shí)驗(yàn)前期實(shí)驗(yàn)組恒河猴血清TG明顯降低，可能的機(jī)制是TC在體內(nèi)劇增后促進(jìn)了肝臟 TG合成，并通過(guò)降低β－氧化反應(yīng)，抑制肝臟脂肪酸代謝和減少肝臟TG向血液分泌，導(dǎo)致血液中TG濃度降低［10］;同時(shí)因前期高脂飼料組的恒河猴日攝入能量低于對(duì)照組，未在體內(nèi)形成能力蓄積增加體內(nèi)TG的合成，反而部分地增加了能量的代謝;在6個(gè)月時(shí)，模型組血清TG已逐漸恢復(fù)到正常水平，這可能是隨著時(shí)間的推移，模型組恒河猴已適應(yīng)高脂飼料，導(dǎo)致日進(jìn)食量與日攝入能量的上升，所以血清TG逐漸恢復(fù)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，采用高脂飼料建立的恒河猴高脂血癥動(dòng)物模型前期表現(xiàn)為血清TC、LDL－C明顯升高，血清TG先降后又逐漸恢復(fù)。根據(jù)高脂血癥在臨床上的分類，用高脂飼料建立的恒河猴高脂血癥動(dòng)物模型符合高 TC血癥和高 HDL－C血癥的特征［10－12］，模型構(gòu)建基本成功。通過(guò)各項(xiàng)指標(biāo)分析，本次實(shí)驗(yàn)已經(jīng)初步建立了實(shí)驗(yàn)性恒河猴高脂血癥動(dòng)物模型，可為人類部分高脂血癥研究提供理想動(dòng)物模型。同時(shí)將延長(zhǎng)高脂飲食誘導(dǎo)動(dòng)物模型的試驗(yàn)周期，觀察隨著時(shí)間的延長(zhǎng)受試動(dòng)物是否會(huì)逐步適應(yīng)高脂飼料而增加采食量和攝入能量，并觀察體重的變化趨勢(shì);同時(shí)觀察TG的變化趨勢(shì)和逆轉(zhuǎn)點(diǎn)，是否會(huì)產(chǎn)生混合型高脂血癥、高甘油三酯血癥、低高密度脂蛋白血癥等，結(jié)果將在后續(xù)的試驗(yàn)中作逐一報(bào)道。

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Establishment and Analysis of Experimental Hyperlipidemia Model in Rhesus Monkey

YANG Feng－mei，LI Yan－yan，LU Shuai－yao，ZHAO Yuan，YU Wen－h(huán)ai，CHEN Li－xiong，WANG Jun－bing，HE Zhan－long
(Institute of Medical Biology，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Yunnan Key Laboratory of Vaccine Research and Development on Severe Infectious Diseases，Kunming，650118，China)

Objective To establish Rhesus monkey model of hyperlipidemia to provide reliable animal model for the study of human hyperlipidemia.Methods Designed high fat experimental feed formulations and detected its nutrients to feed Rhesus monkey to arouse hyperlipidemias.2 mouths、4 mouths、6mouths later，we monitored the body weight，serum total cholesterol(TC)，triglyceride(TG)，high－density lipoprotein cholesterol(HDL－C)，low density lipoprotein cholesterol(LDL－C)，and analyzed the trend of each index above.Results When it was 2 moths and 4 months later，the feed intake and energy intake of model group were lower than control group(P＜0.05)，but the body weight of model group was not significantly different from that of the control group(P ＞ 0.05);When it was 6 moths，the feed intake and energy intake of model group was not significantly different from that of the control group，and the body weight of model group were significantly different from that of the control group(P ＜0.05);When it was 2 moths later，the indexes of TC，TG，HDL－Cand LDL－C of the model group were not significantly different from that of the control group(P ＞ 0.05).When it was 4 moths later，the indexes of TC，TG，LDL－C of the model group were significantly different from that of the control group(P ＜0.05).When it was 6 moths later，the indexes of TC，LDL－C of the model group were significantly different from that of the control group(P ＜ 0.05)，and much higher than the normal levels，but the indexes of TG，HDL－C were not significantly different from that of the control group(P ＞ 0.05).According to the monitoring，TC and LDL－C showed a increase trend，TG showed a gradual recovery after the first descending trend，and the HDL－C was not significantly changed.Conclusion Rhesus monkeys of the model group has a feature of high cholesterol and high low－density lipoprotein cholesterol.The paper has initialy established Rhesus monkey model of experimental hyperlipidemia.

Lipid;Hyperlipidemia;Model，animal;Rhesus monkey

R589.2;R332

A

1671－7856(2012)09－0031－05

10.3969.j.issn.1671.7856.2012.009.007

2012－08－25

云南省技術(shù)創(chuàng)新人才培養(yǎng)基金(2009CI117);云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究面上項(xiàng)目資助課題(2009ZC185M)。

楊鳳梅(1982－)，女，研究實(shí)習(xí)員，碩士，從事實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)研究，E－mail:yangfengmeihei@126.com。

和占龍(1972－)，男，副研究員，碩士，碩士生導(dǎo)師，從事實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)研究，E－mail:hzl@imbcams.com.cn。