東北點地梅下胚軸再生體系的建立

吳麗巍，楊 闊，陶 雙，楊文新，姜長陽

（遼寧師范大學生命科學學院，遼寧大連116081）

東北點地梅（Androsace filiformia）又稱絲點地梅，屬于報春花科點地梅屬一年生草本植物。生長于河邊、路旁、林下、荒地、濕地等環(huán)境中，主要分布在我國的東北、內蒙古等地區(qū)，其中，在遼寧省主要分布在沈陽、鞍山、鳳城、新賓、西豐、開原、長海和桓仁等市縣[1-2]。由于點地梅類植物含有黃酮類藥用成分[3]，使東北點地梅作為中草藥使用具有清熱解毒、消腫止疼等功效，能治扁桃體炎、咽喉炎、口腔炎、急性結膜炎和跌打損傷等疾病[2]。近年來，遼寧地區(qū)家禽養(yǎng)殖專業(yè)戶發(fā)現(xiàn)，把東北點地梅干粉作為飼料添加劑使用，能明顯地降低家禽的發(fā)病率，提高經(jīng)濟效益。于是，很多人于每年的5—6月大量地采收東北點地梅用作家禽的飼料添加劑，這使本來分布和數(shù)量就很少的東北點地梅遭到了嚴重的破壞，導致在遼寧過去有東北點地梅分布的地區(qū)，現(xiàn)已幾近絕跡。為保護東北點地梅的野生資源、滿足人們的需求，研究者采用組織培養(yǎng)的方法，對東北點地梅進行了再生體系建立的研究。雖然有關植物組織培養(yǎng)方面的研究很多[4-8]，并且對點地梅叢生芽繁殖技術的研究也有報道[9]，但迄今未見東北點地梅組織培養(yǎng)和再生體系建立研究的報道。

本研究以東北點地梅有芽下胚軸為材料，采用組織培養(yǎng)的方法，建立起下胚軸的再生體系。

1 材料和方法

1.1 材料來源及滅菌

6月下旬，將生長于大連市長?？h林下生長非常旺盛植株上的東北點地梅的種子采回實驗室，采用高迎秋等[10]研究東方蓼的滅菌方法進行種子滅菌，可獲得無菌種子。

1.2 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)條件參見文獻[11]。

1.3 試驗方法

1.3.1 下胚軸愈傷組織的誘導培養(yǎng) 將無菌種子接種到1/2 MS培養(yǎng)基上，當實生苗長出一片真葉、下胚軸長0.5～0.9 cm時，在近培養(yǎng)基處將具有子葉和一片真葉的下胚軸剪下后，接種到以MS＋ZT 0.2 mg/L＋6-BA 0.1 mg/L為基本培養(yǎng)基、附加不同質量濃度的IAA，IBA和2，4-D培養(yǎng)基上，進行下胚軸愈傷組織的誘導培養(yǎng)試驗。試驗重復3次，每處理接種100個材料。

1.3.2 愈傷組織分化培養(yǎng) 把由下胚軸誘導培養(yǎng)的愈傷組織分散成4～8個顆粒組成、直徑約為0.3 cm的塊狀后，接種到以MS＋NAA 0.1 mg/L為基本培養(yǎng)基，附加不同濃度6-BA，ZT，KT的培養(yǎng)基上，進行愈傷組織的分化培養(yǎng)試驗。試驗重復3次，每處理接種100塊愈傷組織。

1.3.3 生根培養(yǎng) 向生長著繼代增殖培養(yǎng)叢生不定芽的培養(yǎng)瓶倒入7 mL質量濃度為10 mg/L的IAA溶液，處理24 h后，將不定芽從基部分割為獨立的不定芽，接種到1/2 MS培養(yǎng)基上，進行不定芽的生根培養(yǎng)。試驗重復3次，第1次接種200個不定芽，第2次接種400個不定芽，第3次接種800個不定芽。

1.3.4 試管苗移栽與定植 把3次生根培養(yǎng)的試管苗長勢較旺盛的植株從培養(yǎng)瓶中取出后，移栽到鋪著一層6～8 cm厚干凈河沙的溫室苗床上。在移栽后前10 d（濕度保持90%左右、遮陰）對成活率及長勢進行觀察統(tǒng)計。

把移栽成活并正常生長的1 120株試管苗，于5月上旬一次性定植到大連郊區(qū)水庫上游的草地上，按照野生條件任其生長。

2 結果及分析

2.1 不同質量濃度IAA，IBA和2，4-D對下胚軸愈傷組織誘導培養(yǎng)的影響

接種后56 d觀察統(tǒng)計，結果列于表1。

表1 不同質量濃度IAA，IBA和2，4-D對下胚軸愈傷組織誘導培養(yǎng)的影響

由表1可知，在附加不同質量濃度IBA的培養(yǎng)基上，不能誘導下胚軸生長出愈傷組織；在附加不同質量濃度IAA的培養(yǎng)基上，下胚軸的愈傷組織的誘導率也很低；而在附加不同質量濃度2，4-D的培養(yǎng)基上，下胚軸愈傷組織的誘導率效果較好。其中，在附加2.1 mg/L的2，4-D培養(yǎng)基上，愈傷組織的誘導生長效果最好。不僅3次重復試驗的平均誘導率達到了92.3%、半球狀愈傷組織直徑為1.6 cm，而且愈傷組織外觀長勢好。對培養(yǎng)過程的觀察還表明，在附加2.1 mg/L的2，4-D培養(yǎng)基上，培養(yǎng)到9 d時就有約10%的培養(yǎng)材料在下胚軸的下部切口處生長出直徑約為0.1 cm的淡黃色愈傷組織。之后，伴隨著愈傷組織誘導率的增加，先生長的愈傷組織也不斷地長大變綠，并且半球狀愈傷組織的表面也呈現(xiàn)出大小不等的顆粒狀。3次重復試驗的結果基本一致。試驗結果表明，MS＋ZT 0.2 mg/L＋6-BA 0.1 mg/L＋2，4-D 2.1 mg/L是東北點地梅下胚軸愈傷組織誘導培養(yǎng)的理想培養(yǎng)基。

2.2 不同質量濃度6-BA，ZT，KT對愈傷組織分化培養(yǎng)的影響及不定芽的繼代增殖培養(yǎng)

接種培養(yǎng)60 d觀察統(tǒng)計，結果列于表2。

表2 不同質量濃度6-BA，ZT，KT對愈傷組織分化培養(yǎng)的影響

由表2可知，在附加不同質量濃度KT的培養(yǎng)基上，愈傷組織不分化；在附加不同質量濃度6-BA的培養(yǎng)基上，愈傷組織的分化效果較差；在附加不同質量濃度ZT的培養(yǎng)基上，愈傷組織的分化效果較好。其中，在附加0.6 mg/L ZT的培養(yǎng)基上，不僅愈傷組織分化率最高，達到92%，平均每塊愈傷組織能分化生長出5.6個不定芽，而且分化的不定芽長勢較好。對分化培養(yǎng)的過程觀察表明，附加0.6 mg/LZT的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)10 d左右可見在愈傷組織塊的上面分化出不定芽點，隨后伴隨著不定芽的不斷生長，又會相繼在先分化的不定芽基部分化出多個不定芽，且分化的不定芽呈叢生狀。培養(yǎng)到60 d時，叢生狀不定芽就會長成高1 cm左右、外觀生長旺盛的叢生不定芽。

把這種叢生不定芽從基部切割為獨立的不定芽后，接種到相同的培養(yǎng)基上進行不定芽分化繼代增殖培養(yǎng)。3次重復試驗的結果證明，經(jīng)過50 d的分化繼代增殖培養(yǎng)，平均1個不定芽就會分化繼代增殖培養(yǎng)出4.6個不定芽，并且其外觀長勢比由愈傷組織分化培養(yǎng)的不定芽更旺盛。試驗結果表明，MS＋NAA 0.1 mg/L＋ZT 0.6 mg/L是東北點地梅愈傷組織分化培養(yǎng)和不定芽的分化繼代增殖培養(yǎng)的理想培養(yǎng)基。

2.3 不定芽的生根培養(yǎng)

接種后30 d統(tǒng)計，3次重復試驗共接種的1 400個不定芽，生根株數(shù)為1 285個，平均生根率為91.8%。對生根培養(yǎng)過程的觀察表明，接種培養(yǎng)到8 d時，絕大多數(shù)不定芽可發(fā)出新根，生長為試管苗。之后，伴隨著試管苗的生長和生根率的增加，每株試管苗的根數(shù)也不斷增加。培養(yǎng)到30 d時，平均每株試管苗會生長出6.7條白色根，且葉片伸展、嫩綠，長勢旺盛。試驗結果表明，用10 mg/L的IAA溶液對不定芽處理24 h，將不定芽接種到1/2 MS培養(yǎng)基上是東北點地梅不定芽生根培養(yǎng)的理想方法。

2.4 試管苗移栽與定植

3次共移栽1 197株，成活了1 126株，平均成活率為94.1%。定植后30d統(tǒng)計，成活1103株，成活率為98.5%。定植成活的試管苗外觀生長旺盛，7月上旬開花，并保持野生東北點地梅的植物學性狀。

3 討論

本研究所定植的試管苗保持了東北點地梅的植物學性狀，表明本研究所建立的再生技術，能夠為東北點地梅野生資源的保護提供技術支撐。同時表明，采用現(xiàn)代無性繁殖技術，能對植物的種質資源進行保存。

在不定芽生根培養(yǎng)中，本研究采用10mg/L的IAA溶液對不定芽處理24 h，直接接種到1/2 MS培養(yǎng)基上生根的方法收到了較理想的效果，這與IAA特性和試管苗自身的合成力有關。IAA是一種植物自身合成的天然生長素，一定的質量濃度具有促進生根的作用。但是，在不定芽生根培養(yǎng)中，培養(yǎng)初期形成根原基時，需要較高質量濃度的生長素，而根伸長生長所需要的生長素質量濃度較低。而IAA這種天然生長素化學性質不穩(wěn)定，在光照條件下容易分解。所以，用10 mg/L的IAA溶液對不定芽處理，使其促進形成根原基。之后，IAA的分解又有利于根原基的生長，促進試管苗的生根。實際上試管苗根的生長需要較低質量濃度的IAA，而在光照下培養(yǎng)的試管苗本身合成的IAA也能滿足根生長的需要。

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