利用基因芯片分析小麥莖稈伸長過程中的基因表達譜

王創(chuàng)云 ，吳 曦 ，王陸軍 ，趙 麗 ，侯雅靜 ，李海燕

（1.山西騰達種業(yè)有限公司，山西太原030031；2.山西省農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所，山西太原030032；3.太原市星火技術發(fā)展中心，山西太原030009）

株型是小麥品種改良的重要目標性狀，其中莖稈是最重要的株型性狀。近年來，隨著植物生物技術，特別是基于基因芯片的高通量差異表達分析技術的迅速發(fā)展，促進作物生長發(fā)育過程中的基因表達譜研究取得了新的進展[1]，克隆了一批控制株型性狀的基因，這對于闡明作物生長發(fā)育過程的分子調(diào)控機制、通過分子手段改造株型及開展分子育種具有重要意義。

目前，利用基因芯片技術分析植物基因表達譜的研究主要集中在擬南芥和水稻等模式植物上[2]，而對小麥的相關研究較少。李榮華等[3]采用基因芯片技術分析了鋁脅迫下小麥的基因表達譜，馬璐琳等[4]利用Affymetrix芯片分析了DON誘導抗赤霉病小麥品種望水白的基因表達譜。

本研究利用Affymetrix小麥基因芯片分析了鄭麥9023莖稈伸長過程中的基因表達譜，獲得了一批與小麥莖稈伸長相關的候選基因，為進一步探討小麥莖稈伸長的分子機制積累了資料。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

溫室種植小麥品種鄭麥9023，選取生長一致的植株用于取材。分別剝?nèi)“喂?jié)前期及拔節(jié)過程中的基部莖節(jié)組織，迅速在液氮中速凍，置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆肹5]。用于基因差異表達分析的組織材料包括：拔節(jié)前期：拔節(jié)前的基部莖節(jié)組織（V1）、第1節(jié)長度為2 mm的莖節(jié)組織（V2）；拔節(jié)后期：第1節(jié)長度為5 mm的莖節(jié)組織（V3）、第1節(jié)長度為10 mm的莖節(jié)組織（V4）。

1.2 RNA抽提和探針合成

利用TRIzol（美國Invitrogen公司）方法提取各材料的總RNA，并采用RNeasy Mini Kit（德國Qiagen公司）純化總RNA，利用One-cycle cDNA SynthesisKit（美國Affymetrix公司）合成ds cDNA，并用 GeneChip Sample Cleanup Module（美國Affymetrix公司） 純化該 cDNA。然后按照GeneChip IVT LabelingKit說明書制備生物素標記的cRNA，于94℃保溫35 min后進行片段化處理，并作為雜交探針用于基因芯片分析。

1.3 芯片雜交及數(shù)據(jù)分析

采用Affymetrix公司的小麥基因組芯片，其中含有代表55 052個小麥轉錄本的61 127個探針組（http://www.affymetrix.com）。首先，用檢測芯片（test chip）檢測片段化cRNA的質(zhì)量。然后取適量cRNA與試驗芯片（experimental chip）雜交，按照試驗流程進行洗滌、掃描后，用Affymetrix Microarray Suite 5.0軟件對雜交圖像進行分析，并對數(shù)據(jù)均一化。按照芯片上雜交信號的強弱將基因的表達情況分為表達、模糊表達和不表達共3種類型，并對4張芯片的雜交數(shù)據(jù)進行比較。

1.4 基因功能注釋和分類

通過Affymetrix的NetAffx Analysis Center查詢和NCBI的BLASTx分析，對差異表達基因進行功能注釋，并通過MIPS數(shù)據(jù)庫檢索，將候選基因按照功能分類[6]。

2 結果與分析

2.1 小麥芯片雜交數(shù)據(jù)比較

將拔節(jié)后期的2個芯片數(shù)據(jù)（V3，V4）分別與拔節(jié)前期的2個芯片數(shù)據(jù)（V1，V2）比較，得到4種基因表達差異情況散點圖（圖1）。其更直觀地顯示了小麥拔節(jié)不同時期基因表達量的比例信息和信號強度的關系。由圖1可知，小麥拔節(jié)前后有一定數(shù)量的基因存在表達差異（圖1偏離45°中線的點），其中，既有上調(diào)表達的基因，又有下調(diào)表達的基因，本試驗選取2倍線以外的基因轉錄產(chǎn)物為差異性表達基因。

2.2 小麥莖稈伸長過程中的基因差異表達分析

在比較分析小麥拔節(jié)前后基因表達差異過程中，試驗選擇了對小麥莖稈伸長研究有意義且表達差異大于2倍以上的上調(diào)高表達基因作為研究對象，以拔節(jié)前期的基部莖節(jié)組織（V1，V2）為對照，拔節(jié)后期與前期分別比較，2.0倍以上的上調(diào)表達基因，與V1比較分別有2 708，2 654個，共有差異基因1 554個；與V2比較分別有2 169，1 294個，共有差異基因605個；4個比較共有差異基因172個（表1）。總體來看，小麥差異表達主要表現(xiàn)在第1節(jié)長度2 mm到第1節(jié)長度5 mm時期。

表1 小麥莖稈伸長過程中的基因差異表達比較分析

2.3 差異表達基因的功能分類

經(jīng)Affymetrix的NetAffx Analysis Center查詢和NCBI的BLASTx分析發(fā)現(xiàn)，4個比較中，上調(diào)表達2倍以上的基因共有172個，其中的29個已被注釋（表2）。

表2 小麥拔節(jié)過程中已被注釋的29個基因

將經(jīng)過注釋的差異表達基因按照生物學功能分為6類（表3）。

比較各類型基因的數(shù)量發(fā)現(xiàn)，已注釋的候選基因中與轉錄相關、糖代謝、病程相關蛋白基因占了絕大多數(shù),分別占29個注釋基因總數(shù)的62.07%，10.34%和13.79%，其他功能基因所占比例較少。在這些表達變化倍數(shù)較高的基因中，轉錄相關基因最多（18個），包括8個MADS-box家族轉錄因子，6個CAF轉錄因子，3個NAC類轉錄因子。

表3 小麥拔節(jié)過程中29個已被注釋基因生物學功能分類

2.4 小麥莖稈伸長過程中功能基因的差異表達變化

從圖2可以看出，變化趨勢較大的前10個基因，5個是與轉錄相關的MADS-box家族基因，且表達趨勢都是隨著小麥拔節(jié)過程逐步加強；3個是與病程相關蛋白基因，2個是與糖代謝相關基因。其中，變化最大的探針編號為TaAffx.143995.17.S1_s_at的 LOC543103是 MADS-box家族基因；變化次之的探針編號為Ta.20121.1.S1_x_at的TaGlb2b是糖代謝相關基因。

3 結論與討論

小麥莖稈高度是解決倒伏問題的重要途徑。以往的研究表明，赤霉素（gibberellin，GA）和油菜素類固醇（brassinosteroid，BR）參與節(jié)間的發(fā)育過程，另外，多胺也影響植株的高度[7]。與它們共同參與調(diào)節(jié)莖稈高度的基因主要分為2類，一類影響信號的轉導，一類影響生物合成。

轉錄因子（反式作用因子）基因是植物中最重要的一類調(diào)節(jié)基因，其在植物體內(nèi)構成復雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡，在時間和空間上協(xié)同控制基因的表達。轉錄因子是能夠與真核基因啟動子區(qū)域中順式作用元件發(fā)生特異性作用的DNA結合蛋白，通過它們之間以及與其他相關蛋白之間的相互作用，激活或抑制基因轉錄[8-9]。

本研究中已經(jīng)注釋的29個與小麥莖稈伸長相關的基因中，有18個與轉錄相關的基因，所占比例達到62.07%。這與前人研究結果相一致[7]。在18個轉錄相關基因中，主要包括3類轉錄因子：MADS-box，CAF和NAC，其中，基因表達差異變化趨勢較大的前10個基因中，5個是MADS-box家族轉錄因子，且表達趨勢都是隨著小麥的拔節(jié)過程而逐步加強，變化最大的LOC543103正是MADS-box家族轉錄因子。但它們是否直接或間接參與了小麥的GA，BR和多胺的生物合成，以及它們不同的表達模式，這些還有待于進一步研究。

綜上所述，在小麥的拔節(jié)過程中，有多個MADS-box基因的表達發(fā)生了變化，并且在莖節(jié)的表達量較高，變化也較為顯著，這說明MADS-box基因可能參與了小麥莖稈過程中莖節(jié)的伸長，為進一步理解這些基因的功能提供了有利的材料。

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［3］李榮華，郭培國.用基因芯片技術分析鋁脅迫下小麥的基因表達譜譜[J].生物技術通訊，2007，18（4）：581-586.

［4］馬璐琳，尚毅，亓增軍，等.利用Affymetrix芯片分析DON誘導抗赤霉病小麥品種望水白的基因表達譜 [J].麥類作物學報，2009，29（6）：959-964.

［5］王創(chuàng)云，王美霞，盧成達，等.小麥拔節(jié)過程中差異表達基因WSR1的克隆及序列分析 [J].山西農(nóng)業(yè)科學，2009，37（3）：22-24.

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