BMSC向神經(jīng)細(xì)胞分化誘導(dǎo)后上清液對MCI大鼠治療作用的實(shí)驗(yàn)研究

郭 樑，張 軼，李光來

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD），是一種神經(jīng)退行性疾病，是癡呆病中最常見的類型。目前尚無公認(rèn)有效的治療方法。輕度認(rèn)知功能障礙（mild cognitive impairment，MCI）[1]是癡呆的臨床前期，是介于正常衰老和癡呆之間的一種認(rèn)知功能損害狀態(tài)[2]。抑制甚至逆轉(zhuǎn)MCI過程，成為預(yù)防并控制AD研究熱點(diǎn)。已有研究通過體內(nèi)外干預(yù)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)一定濃度、時(shí)段骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC）向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)后上清液可以顯著激活腦損傷后自體神經(jīng)前體細(xì)胞（NPCs）增殖和分化，說明BMSC上清液可部分啟動(dòng)內(nèi)源性修復(fù)機(jī)制，從而在某種程度上促進(jìn)腦損傷的功能康復(fù)。本文旨在探索不同代次BMSC向神經(jīng)細(xì)胞分化誘導(dǎo)后上清液對認(rèn)知功能障礙大鼠是否有治療作用以及各代次之間是否有差別。

1 材料與方法

1.1 材料 Wistar大鼠（山西醫(yī)科大學(xué)生理實(shí)驗(yàn)室）、DMEM／low（Hyclone）、胎牛血清（杭州四季）、PBS磷酸鹽緩沖液、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF，PeproTech）、4%多聚甲醛、鼠免疫組化試劑盒（美國ZYMED公司）、DAB、顯色試劑盒（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）、倒置顯微鏡、5%CO2培養(yǎng)箱、流式細(xì)胞儀等。

1.2 大鼠BMSC的分離、培養(yǎng)和鑒定 BMSC采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法，將細(xì)胞置于5%CO2，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，待細(xì)胞生長融合至70%～85%時(shí)傳代。取第3代的BMSC，按105／mL水平分5管分別加入F ITC標(biāo)記的小鼠抗大鼠CD29、CD44和CD45抗體，同型F ITC標(biāo)記的對照IgG以及空白對照，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測。

1.3 細(xì)胞爬片和誘導(dǎo) 分別取第3代、4代、5代BMSC，按105／mL濃度接種于鋪有蓋玻片的六孔板內(nèi)，加入含1mmol／L βME和20%胎牛血清的L－DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行預(yù)誘導(dǎo)。24h后棄預(yù)誘導(dǎo)液。加入bFGF 20ng／mL和10%胎牛血清。免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定：取誘導(dǎo)后24h細(xì)胞爬片，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定30min；PBS沖洗3次，3%H2O237℃孵育15min消除內(nèi)源性過氧化物酶活性；PBS沖洗3次，山羊血清室溫封閉10min，棄血清后分別加入兔抗大鼠NSE、GFAP抗體，4℃過夜；PBS洗3次后加入生物素標(biāo)記的二抗，室溫下孵育30min；PBS沖洗3次，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，37℃孵育30min；PBS洗滌，DAB顯色。陰性對照用PBS代替一抗。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇與處理 3個(gè)月齡大鼠10只為正常組，根據(jù)Phiel等[3]報(bào)道的Morris水迷宮測試方法進(jìn)行測試，Morris水迷宮行隱蔽平臺獲得實(shí)驗(yàn)確立認(rèn)知功能障礙大鼠標(biāo)準(zhǔn)：平均潛伏期較正常組延長20%以上者定義為認(rèn)知功能障礙大鼠。

15個(gè)月～22個(gè)月齡大鼠Morris水迷宮行隱蔽平臺獲得實(shí)驗(yàn)篩選認(rèn)知功能障礙大鼠40只（相對于人為制造認(rèn)知功能障礙大鼠模型，從自然衰老大鼠中挑選認(rèn)知功能障礙大鼠，或許更加符合自然規(guī)律，使實(shí)驗(yàn)更有意義），隨機(jī)分為生理鹽水對照組（對照組）及3代、4代、5代干細(xì)胞傳代誘導(dǎo)后12h上清液治療組并做好標(biāo)記，組間大鼠認(rèn)知功能障礙程度確保無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)行行為學(xué)檢測：Morris水迷宮隱蔽平臺獲得實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)方法參照劉濤等[4]進(jìn)行的定位巡航實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行，歷時(shí)5d，前4d學(xué)習(xí)訓(xùn)練，采納第5天實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行記錄統(tǒng)計(jì)。參照包新民等所著《大鼠腦立體定位圖譜》，選擇雙側(cè)海馬CA1區(qū)為注射靶區(qū)，在嚴(yán)格無菌條件下，于前囟向后3.0mm，中線旁開2.2mm處，用牙科鉆鉆開顱骨，微量進(jìn)樣器自腦表面垂直進(jìn)針2.8mm，將生理鹽水、3代、4代、5代干細(xì)胞傳代誘導(dǎo)后12h上清液0.5 μL／min各組緩慢注入3μL，留針10min以保證溶液充分彌散，然后緩慢撤針。皮膚切開處用青霉素涂撒，縫合切口。注射上清后4周4組大鼠再次進(jìn)行行為學(xué)檢測。

1.5 免疫組織化學(xué)染色測定周期蛋白依賴性激酶5（CDK5）表達(dá)程度 迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后各組大鼠經(jīng)10%水合氯醛腹腔麻醉（3mL／kg），經(jīng)左心室（同時(shí)剪開右心房）相繼灌注生理鹽水200 mL，40g／L多聚甲醛（4℃）400mL?？焖偃∧X，固定24h，腦組織常規(guī)石蠟包埋，矢狀連續(xù)切片，片厚4μm。周期素依賴性激酶5抗體為一抗行免疫組化染色。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠BMSC的光鏡形態(tài)與細(xì)胞鑒定 培養(yǎng)2周左右細(xì)胞匯合至70%～80%時(shí)傳代，24h后BMSC即可貼壁生長，4d～5d可基本匯合。傳至3代后，細(xì)胞呈旋渦狀排列的均一梭形。流式細(xì)胞儀檢測CD29、CD4 4和CD3 4的表達(dá)率為9 9.7%、99.8%和2.3%，說明所分離培養(yǎng)的細(xì)胞符合MSC表型特征。

2.2 誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)變化與免疫化學(xué)鑒定 預(yù)誘導(dǎo)24h，可見少量細(xì)胞逐漸向胞核方向收縮，加入bFGF后上述變化更加明顯，可見突起形成。從上下左右中5個(gè)方位分別選取2個(gè)非重疊視野（10×40），計(jì)數(shù)每個(gè)視野下NSE與GFAP陽性細(xì)胞所占比例：各組細(xì)胞均有部分細(xì)胞NSE陽性，表現(xiàn)為胞漿呈黃棕色，陽性率為（42.50±6.40）%，GFAP染色后各誘導(dǎo)組出現(xiàn)極少量陽性細(xì)胞。

2.3 水迷宮實(shí)驗(yàn) 4組注射前后定位巡航實(shí)驗(yàn)潛伏期差值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝56.481，P＜0.001），進(jìn)一步行LSD－t檢驗(yàn)，除3代組與5代組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，其他任何兩組間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），3代與5代上清液較4代效果明顯。詳見表1。

表1 4組注射前后定位巡航實(shí)驗(yàn)潛伏期差值比較（±s）

表1 4組注射前后定位巡航實(shí)驗(yàn)潛伏期差值比較（±s）

組別 差值對照組 0.779 7±1.813 4 3代組 71.159 1±1.055 91）4代組 53.063 7±1.659 41）2）5代組 76.726 2±1.151 21）3）與對照組比較，1）P＜0.01；與3代組比較，2）P＜0.05；與4代組比較，3）P＜0.05

2.4 各組腦組織邊緣系統(tǒng)CDK5表達(dá)情況 于海馬齒狀回從上下左右中5個(gè)方位分別選取2個(gè)非重疊視野（10×40），計(jì)算每個(gè)視野下陽性細(xì)胞（表現(xiàn)為胞漿呈黃棕色）所占比例，行Kruskal－Wallis檢驗(yàn)顯示，4組CDK5表達(dá)情況總體分布不同或不全相同（χ2＝32.046，P＜0.001），進(jìn)一步應(yīng)用 Wilcoxon秩和檢驗(yàn)分別對4組行組間兩兩比較，除3代組與5代組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，余各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，3代（平均秩和＝5.50）與5代（平均秩和＝5.50）上清液組較4代（平均秩和＝6.00）CDK5表達(dá)陽性率低。詳見表2。

表2 4組大鼠注射上清液前后邊緣系統(tǒng)CDK5表達(dá)兩兩比較

3 討 論

阿爾茨海默病主要特征是在腦中出現(xiàn)非正常的蛋白質(zhì)沉積，該蛋白質(zhì)沉積大致可以分為兩種：細(xì)胞外被稱為“老年斑”的淀粉樣多肽沉積；細(xì)胞內(nèi)的神經(jīng)纖維纏結(jié)（neurofibrillary tangles，NFT），NFT主要由雙螺旋纖維（paried helical filaments，PHF）聚集而成，而研究表明病理的雙螺旋纖維主要是由過度磷酸化的Tau蛋白組成[5]。Dubois等[6]認(rèn)為有記憶缺失等癥狀的MCI是AD發(fā)展的極早期階段，而研究表明在AD的臨床前期腦內(nèi)已經(jīng)出現(xiàn)神經(jīng)元纖維纏結(jié)發(fā)生[7]，而磷酸化tau蛋白水平與CDK5表達(dá)呈正相關(guān)且老年癡呆大鼠皮層、海馬CDK5表達(dá)明顯升高[8]。通過本次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，三組注射上清液的大鼠腦組織海馬齒狀回CDK5表達(dá)陽性率較生理鹽水對照組為低，且3代與5代上清液相對明顯，這應(yīng)該可以在某種程度上說明，上清液的注入通過某種途徑改善了紊亂的tau蛋白磷酸化調(diào)控機(jī)制。

已有研究證實(shí)不同時(shí)間誘導(dǎo)后上清液在骨髓間充質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化中具有明顯的誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞的作用[9]，亦有研究通過體內(nèi)干預(yù)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)一定濃度BMSCs培養(yǎng)上清液可以顯著激活腦梗死后自體NPCs增殖和分化，說明BMSCs上清液可部分啟動(dòng)內(nèi)源性修復(fù)機(jī)制，從而在某種程度上促進(jìn)腦缺血的功能康復(fù)[10]，通過本次實(shí)驗(yàn)，證明這種效應(yīng)在認(rèn)知功能障礙老年性腦損傷的修復(fù)中同樣起到一定作用：將3代、4代、5代BMSC向神經(jīng)元樣細(xì)胞誘導(dǎo)后12h上清液注射入大鼠海馬區(qū)后1個(gè)月，大鼠行Morris水迷宮隱蔽平臺獲得實(shí)驗(yàn)潛伏期明顯縮短，這表明，誘導(dǎo)后上清液的治療作用對抗了手術(shù)損傷與術(shù)后自然衰老1個(gè)月對其產(chǎn)生的負(fù)面影響，同時(shí)對其認(rèn)知功能的恢復(fù)起到了積極地促進(jìn)作用，并在一定程度上避免了干細(xì)胞移植與藥物治療存在的倫理、成腫瘤風(fēng)險(xiǎn)與不良反應(yīng)等暫時(shí)無法克服的問題。但是，BMSC向神經(jīng)元樣細(xì)胞誘導(dǎo)后12h上清液改善大鼠認(rèn)知功能障礙的具體機(jī)制是什么；為什么不同代次上清液對大鼠認(rèn)知功能障礙改善效果會(huì)有差異，特別是為什么本次實(shí)驗(yàn)中處于3代、5代之間的4代組效果略欠；上清液中有哪些成分，具體是何物質(zhì)對認(rèn)知功能障礙的改善起作用；上清液對MCI的治療有何不良反應(yīng)等，尚需行進(jìn)一步探討研究。

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