黃連解毒湯對(duì)膿毒癥大鼠的心臟保護(hù)作用1）

黃 鑫，郭力恒，馬世玉，張敏州，王 磊

膿毒癥是臨床上常見的急危重癥并發(fā)癥，其發(fā)展所致的重度膿毒癥、膿毒癥休克、器官功能障礙綜合征（MODS）等死亡率很高，是目前ICU中的主要死亡原因。雖然近年來對(duì)膿毒癥及MODS的認(rèn)識(shí)和治療研究有了很大進(jìn)展，但MODS的病死率仍沒有明顯改善，發(fā)病機(jī)制仍不清楚，很多研究人員致力于尋找降低器官功能衰竭發(fā)生率和嚴(yán)重程度，阻止膿毒癥向膿毒性休克和MODS發(fā)生的治療措施。研究發(fā)現(xiàn)，膿毒血癥、伴有臟器功能衰竭的重度膿毒血癥或膿毒性休克病人常常出現(xiàn)不同程度的心功能障礙或心力衰竭，而心功能障礙又是膿毒血癥病情加重及影響預(yù)后的重要因素[1，2]。本研究嘗試從心臟角度探討清熱解毒方劑黃連解毒湯對(duì)膿毒癥后心肌的保護(hù)作用，為尋找中醫(yī)藥防治膿毒癥心功能障礙提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 清熱解毒方劑黃連解毒湯組方：黃連10g，黃芩10g，黃柏10g，梔子10g，大黃10g。中藥經(jīng)水提取，濃縮為含生藥0.75g／mL作為高劑量，用蒸餾水稀釋，調(diào)整濃度為含生藥0.25g／mL作為低劑量。按人鼠劑量比1∶6.3灌胃，即100g大鼠灌胃量為1.5mL，密封包裝，放入冰箱備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠50只，體重為（220±10）g，廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：粵監(jiān)證字0083834；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)環(huán)境設(shè)施合格證號(hào)：粵監(jiān)證字0056182。

1.3 儀器 BIOPAC sYSTEMS（MP150型）16道生理系統(tǒng)記錄儀（美國），正置熒光顯微鏡（奧林巴斯BX53），Anke TDL－5－A低溫離心機(jī)、LIBROR AEU－210型電子分析天平、DT－1TB電子體溫計(jì)（上海醫(yī)用儀表廠）等。

1.4 盲腸結(jié)扎穿孔法制備膿毒癥大鼠模型 參照文獻(xiàn)[3]中設(shè)計(jì)的大鼠盲腸結(jié)扎穿孔（CLP）方法復(fù)制膿毒癥模型。大鼠術(shù)前禁食12h、自由飲水，稱體重后10%水合氯醛（0.35mL／100g）進(jìn)行腹腔注射麻醉，在無菌操作條件下取中下腹部正中切口2 cm，將盲腸提出，用4號(hào)絲線在盲腸中段結(jié)扎，用18G針頭在結(jié)扎部位與盲腸末端的中段對(duì)穿兩孔，使腸內(nèi)容物流出，然后將盲腸還納腹腔后逐層關(guān)腹。術(shù)畢動(dòng)物皮下注射平衡液50mL／kg行液體復(fù)蘇，喂食同術(shù)前。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組與給藥 50只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和黃連解毒湯組。假手術(shù)組除不結(jié)扎和穿刺盲腸，余同模型組；模型組采用盲腸結(jié)扎并穿刺法造模，術(shù)前1h給予注射生理鹽水（10mL／kg）灌胃；黃連解毒湯組術(shù)前1h灌胃黃連解毒湯1.5mL／100g。

1.6 檢測指標(biāo) 每天觀察記錄大鼠的生存狀態(tài)（精神狀態(tài)、飲食、體重等），觀察記錄大鼠生存時(shí)間。內(nèi)眥靜脈叢采血法分別在術(shù)前、術(shù)后收集血液，離心（3 000r／min，4℃，7min）后，免疫化學(xué)發(fā)光法檢測血清肌酸激酶（CK）及其同工酶（CK－MB）水平，ELISA檢測血液中腫瘤壞死因子（TNF－α）水平。采血后留取左室心肌標(biāo)本，用10%甲醛固定，進(jìn)行病理切片并行HE染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織病理改變。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠生存周期的觀察 大鼠在CLP造模后出現(xiàn)寒戰(zhàn)、豎毛、嗜睡、活動(dòng)減少、飲食減少等膿毒癥的表現(xiàn)，證明造模成功。72h內(nèi)假手術(shù)組大鼠無死亡；模型組24h死亡數(shù)量顯著增加，72h后僅余2只存活；黃連解毒湯組24h死亡7只，72h后仍有8只存活。與模型組比較，72h內(nèi)黃連解毒湯組生存周期延長（P＜0.05）。詳見表1。

表1 各組生存周期比較（±s）

表1 各組生存周期比較（±s）

組別 n 死亡（只）24h48h72h存活只平均生存天數(shù)d假手術(shù)組10 0 0 0 6 3模型組 20 12 5 1 2 1.55±0.171）黃連解毒湯組 20 7 3 2 8 2.15±0.211）2）與假手術(shù)組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.05

2.2 各組大鼠呼吸、心率和體溫的變化 在造模后，分別檢測各組大鼠的呼吸、心率和體溫。結(jié)果顯示，模型組和黃連解毒湯組大鼠體溫升高，呼吸頻率、心率增快，與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組相比，黃連解毒湯組大鼠體溫下降，呼吸頻率、心率減慢，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。詳見表2。

表2 各組大鼠心率、呼吸、體溫比較（±s）

表2 各組大鼠心率、呼吸、體溫比較（±s）

組別 心率（次／min） 呼吸（次／min） 體溫（℃）假手術(shù)組361.6±12.4 87.2±3.2 34.88±0.15模型組 551.0±4.91） 143.8±4.81） 38.48±0.111）黃連解毒湯組 454.0±16.51）2） 113.2±8.11）2） 37.32±0.391）2）與假手術(shù)組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.01

2.3 各組大鼠血清CK、CK－MB水平檢測 模型組和黃連解毒湯組大鼠的CK和CK－MB水平均有所上升，與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組相比，黃連解毒湯組大鼠CK和CK－MB水平有所下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見表3。

2.4 各組大鼠血清TNF－α水平檢測 模型組和黃連解毒湯組大鼠的TNF－α水平有所增加，與假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），與模型組相比，黃連解毒湯組大鼠TNF－α水平有所下降（P＜0.05）。詳見表3。

表3 各組大鼠血清心肌酶和TNF－α水平比較（±s）

表3 各組大鼠血清心肌酶和TNF－α水平比較（±s）

組別 CK（ng／mL） CK－MB（ng／mL） TNF－α（ng／L）假手術(shù)組435.2±30.4 481.8±32.5 182.81±13.68模型組 871.4±21.71） 988.0±30.91） 353.41±12.051）黃連解毒湯組 621.3±19.11）2） 753.6±25.51）2） 251.60±11.131）2）與假手術(shù)組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.05

2.5 大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)變化 假手術(shù)組心臟標(biāo)本心肌細(xì)胞無變性壞死，心肌橫紋清晰，未見炎癥細(xì)胞浸潤；模型組心臟標(biāo)本可見灶性心肌纖維斷裂，心肌細(xì)胞有顆粒樣變性、空泡變性和凝固性壞死，冠狀動(dòng)脈內(nèi)明顯充血；黃連解毒湯組雖可見上述病理改變，但程度有所減輕。

3 討 論

膿毒癥被定義為感染誘發(fā)的全身炎癥反應(yīng)[4]，是臨床常見的急危重疾病之一。美國每年有75萬的膿毒癥患者，約有21.5萬人死亡[5]。我國10家外科ICU一年嚴(yán)重膿毒癥的發(fā)病率為8.68%，住院期間總死亡率為48.7%，平均每個(gè)病人住院費(fèi)用約11 000美元[6]。近年來，盡管早期積極抗感染、液體復(fù)蘇和器官支持等治療方法的應(yīng)用，但膿毒癥總體死亡率并沒有明顯下降。中醫(yī)藥治療感染性疾病有豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)，在這個(gè)偉大的寶庫中尋找新的膿毒癥的防治方法被寄予厚望。

從癥狀表現(xiàn)和演變過程來看，膿毒癥與《傷寒論》和《溫病》中所論述的溫?zé)岵∮兄T多相似之處，故膿毒癥屬于中醫(yī)學(xué)“熱病”范疇。黃連解毒湯是清熱解毒方中的經(jīng)典方劑，該方由黃連、黃芩、黃柏、梔子組成，具有瀉火解毒之功效，是歷代清熱解毒的代表方，主治實(shí)熱火毒、三焦熱盛之證。翁書和等[7]用以黃連解毒湯加減方治療MODS大鼠模型，結(jié)果顯示黃連解毒湯對(duì)MODS大鼠的臟器有明顯保護(hù)作用，并且可以明顯延長MODS大鼠的存活時(shí)間，其機(jī)制可能與抑制或清除有害炎癥介質(zhì)及腸道細(xì)菌和毒素有關(guān)。

盲腸結(jié)扎穿孔（CLP）法制備膿毒癥動(dòng)物模型與臨床上患者膿毒癥的發(fā)病極為相似，是制作膿毒癥、感染性休克及 MODS模型的常用方法之一。本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠在造模后出現(xiàn)寒戰(zhàn)、豎毛、嗜睡、活動(dòng)減少、飲食減少，并且出現(xiàn)體溫升高、呼吸頻率、心率增快等膿毒癥的表現(xiàn)，其72h后只有2只大鼠存活。將死亡大鼠進(jìn)行解剖，發(fā)現(xiàn)腹腔有較多黃色或血色腹水，并伴有惡臭；腸管壁充血、腫脹，符合腹腔感染所致膿毒癥模型。而假手術(shù)組則未見相應(yīng)表現(xiàn)，72h后未出現(xiàn)死亡。黃連解毒湯組則上述癥狀有所減輕，72h后仍有8只大鼠存活，生存時(shí)間明顯延長，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。提示黃連解毒湯能夠減輕大鼠膿毒癥表現(xiàn)，并延長大鼠的生存時(shí)間，與文獻(xiàn)[7，8]報(bào)道一致。

膿毒癥的死亡率與心功能密切相關(guān)，膿毒癥患者一旦出現(xiàn)心功能障礙，死亡率將由20%上升到40%～70%，已有研究證實(shí)膿毒癥可引起心肌收縮功能抑制[9]。Labugger等[10]研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥時(shí)心臟不僅存在功能性改變，也存在結(jié)構(gòu)性損傷。心肌酶及其同工酶是反應(yīng)心肌損傷的敏感指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)模型組血清CK和CK－MB較假手術(shù)組顯著升高（P＜0.01），提示膿毒癥早期即發(fā)生心肌損傷。病理檢查發(fā)現(xiàn)模型組心肌表面有點(diǎn)狀出血，光鏡下可見廣泛心肌出血，毛細(xì)血管充血，炎癥細(xì)胞浸潤，心肌纖維斷裂，證實(shí)膿毒癥確實(shí)存在心肌損害。而黃連解毒湯組大鼠心肌組織病理改變有所減輕，且血清中CK和CK－MB水平較模型組有所下降（P＜0.01），提示黃連解毒湯對(duì)膿毒癥大鼠心臟具有保護(hù)作用。

TNF－α是膿毒癥時(shí)最早釋放，起關(guān)鍵始動(dòng)作用的細(xì)胞因子，可激活細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘發(fā)IL－1、IL－6、前列環(huán)素、一氧化氮（NO）和白三烯等合成，從而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)失控，是炎癥反應(yīng)中激活細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)的主要介質(zhì)。其濃度高低與疾病的嚴(yán)重程度和后果一致，TNF－α的濃度越高，膿毒癥越嚴(yán)重，死亡率越高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，膿毒癥大鼠血清TNF－α水平明顯增高，而黃連解毒湯可降低膿毒癥大鼠的TNF－α濃度，減輕心肌細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，證明黃連解毒湯對(duì)膿毒癥的治療機(jī)制可能是通過抑制炎癥反應(yīng)從而改善膿毒癥大鼠的心功能。

黃連解毒湯有延長膿毒癥大鼠的生存時(shí)間、減輕炎癥因子對(duì)的心臟損傷、保護(hù)大鼠心臟功能的作用。本研究為臨床應(yīng)用中醫(yī)藥防治膿毒癥提供了一條新的思路，但黃連解毒湯治療膿毒癥的心功能障礙的具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

[1]Parker MM，Natanson C，Suffredini AF，et al.Septic shock in human：Advances in the understanding of pathogenesis，cardiovascular dysfunction，and therapy[J].Ann Intern Med，1990，113：227－242.

[2]Tabbutt S.Heart failure in pediatric septic shock：Utilizing inotropic support[J].Crit Care Med，2001，29（10）：231－236.

[3]Rittirsch D，Huber－Lang MS，F(xiàn)lierl MA，et al.Immunodesign of experimental sepsis by cecal ligation and puncture[J].Nat Protoc，2009，4（1）：31－36.

[4]Dellinger RP.Surviving Sepsis Campaign：International guidelines for management of severe sepsis and septic shock[J].Intensive Care Med，2008，37：17－60.

[5]Angus DC，Linde－Zwirble WT，Lidicker J，et al.Epidemiology of severe sepsis in the United States：Analysis of incidence，outcome，and associated costs of care[J].Crit Care Med，2001，29：1303－1310.

[6]Cheng B，Xie G，Yao S，et al.Epidemiology of severe sepsis in criti－cally ill surgical patients in ten university hospitals in China[J].Crit Care Med，2007，35（11）：2538－2546.

[7]翁書和，梁俊雄，丁愛民.通腑益氣法對(duì)多器官功能障礙大鼠全身炎癥反應(yīng)的調(diào)控[J].廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，21（2）：148－150.

[8]江漢奇.黃連解毒湯治療全身炎癥反應(yīng)綜合征的臨床觀察[J].光明中醫(yī)，2009，24（3）：480.

[9]Dhninaut JF，Cariou A ，Laurent I.Myocardial dysfunction in sepsis[J].Sepsis，2001，4（2）：89－97.

[10]Labugger R，Organ L，Collier C，et al.Extensive troponin I and T modification detected in serum from patients with acute myocar dial infarction[J].Circulation，2000，102（11）：1221－1226.