我國煙區(qū)病毒病種類的血清學(xué)鑒定

羅朝鵬，楊 軍，王 燃，李 峰，金立鋒，魏春陽，林福呈

中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2號 450001

煙草病毒病是危害煙草的主要病害之一，給煙葉生產(chǎn)造成巨大損失[1-2]。2010年我國煙草病毒病發(fā)生面積57140 hm2，造成產(chǎn)量損失3632.5 t，產(chǎn)值損失3911.05萬元，占煙草病蟲害總損失率的18.99%[3]。國外報道侵染煙草的病毒有近40種[2,4]，我國發(fā)現(xiàn)的有20種左右[5-16]，其中，煙草普通花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）、黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）和馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）3種病毒發(fā)生最為普遍，是侵染我國煙草的主要病毒種類[5-6,17-24]。煙草蝕紋病毒（Tobacco etch virus,TEV）在我國主要煙區(qū)均有發(fā)生，但不同煙區(qū)嚴重程度不同，四川、陜西和山東煙區(qū)感染率較高[5,21-23,25-26]。而對于其他病毒的報道較少。近年來，隨著全球氣候的變化、耕作制度變革和農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，煙草病毒病發(fā)生呈現(xiàn)3種明顯特征。首先，新病毒不斷出現(xiàn)，并且在一些地區(qū)造成嚴重危害。由煙草叢頂病毒（Tobacco bushy top virus，TBTV）和煙草扭脈病毒（Tobacco vein distorting virus，TVDV）復(fù)合侵染引起的煙草叢頂病，給云南煙葉生產(chǎn)造成巨大損失[12,16]。煙草曲莖病毒（Tobacco curly shoot virus，TbCSV）、云南煙草曲葉病毒（Tobacco leaf curl Yunnan virus，TLCYNV）及中國番茄黃化曲葉病毒（Tomato yellow leaf curl China virus，TYLCCNV）等雙生病毒單獨或復(fù)合侵染引起的煙草曲葉病已在云南、廣西等省煙區(qū)爆發(fā)流行[7-11]。最近，首次在我國煙草上檢測出蕪菁花葉病毒（Turnip mosaic virus，TuMV）和番茄花葉病毒（Tomato mosaic virus，ToMV）2種病毒，侵染率高達36.84%和34.59%[6,27]。其次，優(yōu)勢毒原不斷變化，偶發(fā)性病毒病害危害擴大。1989～1991年進行的“全國煙草侵染性病害調(diào)查研究”項目研究結(jié)果表明，TMV和CMV是危害我國煙草的主要病毒種類，馬鈴薯X病毒（Potato virus X，PVX）病只是云南、四川、貴州和重慶等煙區(qū)的偶發(fā)性病毒病害。近年的研究發(fā)現(xiàn)，PVY已經(jīng)成為我國煙草的優(yōu)勢毒原[6,20-21]，PVX在湖南、河南和山東等煙區(qū)逐漸開始流行，河南和山東煙區(qū)檢出率較高[20-22]。我國煙草病毒病發(fā)生的第三個特征是病毒病田間復(fù)合侵染十分嚴重，田間癥狀表現(xiàn)更加復(fù)雜。青玲等[6]對我國7個主要煙區(qū)5種病毒檢測結(jié)果表明，共存在9種復(fù)合侵染類型，復(fù)合侵染率為62.26%。其中5種病毒共同侵染的樣品比例高達55.63%，復(fù)合侵染極為嚴重，病毒病表現(xiàn)出復(fù)雜的大田癥狀，其他研究也得到相似的研究結(jié)果[17-18,20-25]。1989～1991年，“煙草侵染性病害調(diào)查研究協(xié)作組”對全國煙區(qū)病毒病種類進行了系統(tǒng)調(diào)查和研究，明確了侵染我國煙草的病毒種類及發(fā)生分布情況。其后，未曾進行過類似研究。近年的研究結(jié)果顯示，一些煙區(qū)主要病毒病種類已經(jīng)發(fā)生了明顯變化，新病毒在一些煙區(qū)爆發(fā)并造成嚴重損失，復(fù)合侵染日趨嚴重，癥狀表現(xiàn)更加復(fù)雜。因此，亟需對全國范圍內(nèi)煙草病毒病發(fā)生情況進行研究，以摸清當(dāng)前我國煙區(qū)煙草病毒主要種類和變化趨勢、病毒種群區(qū)系分布及復(fù)合侵染情況，為制定病毒病的防控策略提供依據(jù)。

1 材料方法

1.1 樣品采集

2010和2011年從云南、貴州、福建、湖南、湖北、安徽、陜西、河南、山東、黑龍江、遼寧、廣西、浙江等13個主要產(chǎn)煙省采集病毒病煙葉樣品，新鮮樣品直接進行血清學(xué)檢測，其余樣品保存于-80℃冰箱，備用。

1.2 樣品ELISA鑒定

使用Agdia公司PVY，TEV，TMV和TEV ELISA檢測試劑盒，對采集的煙葉樣品進行血清學(xué)鑒定，具體參照使用說明。雙波長測定OD值（405 nm和630 nm）。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)為待檢樣品OD值（P）比陰性對照 OD值（N）P/N≥2.1為陽性，1.5≤P/N<2.1為疑似感染，P/N<1.5為陰性。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品采集

從13個主要煙區(qū)采集了病毒病煙葉樣品409份，其中2010年采集樣品154份，2011年采集樣品255份。從采樣點和采樣數(shù)量來看，2011年較2010年采樣數(shù)量和覆蓋率都有所增加。詳細信息見表1。

根據(jù)兩年采樣調(diào)查結(jié)果，可以將煙草病毒病田間癥狀分為6類：①植株矮化。該癥狀常與其他癥狀同時表現(xiàn)，尤其是和壞死及畸形等癥狀伴隨出現(xiàn)較為常見；②葉片畸形。包括葉尖變細，葉片扭曲皺縮、葉面皰斑等癥狀；③脈壞死，葉脈褐色壞死。癥狀首先從支脈表現(xiàn)，發(fā)展到主脈。嚴重時葉片從下到上依次黃化萎蔫，最后整株死亡；④花葉。包括葉片局部褪綠黃化、局部顏色變深等癥狀；⑤環(huán)斑。包括褪綠環(huán)斑和壞死環(huán)斑等癥狀；⑥蝕紋。表現(xiàn)為點狀白色線條或不規(guī)則環(huán)狀線。其主要病毒病的癥狀見圖1。

圖1 煙草病毒病的主要癥狀類型

2.2 我國煙草病毒病的發(fā)生狀況

4種煙草病毒ELISA檢測結(jié)果（表2）顯示，TMV侵染率最高，2010年樣品總侵染率高達63.6%，2011年為48.2%。2010年樣品CMV總侵染率為32.1%，2011年為28.2%；PVY的總侵染率2010年為15.6%，2011年為11.4%；TEV的侵染率最低。可見，TMV和CMV仍然是侵染我國煙草的主要病毒種類，這與1989～1991年進行的“全國煙草侵染性病害調(diào)查研究”項目研究結(jié)論一致[5]，也與劉勇[18]等的研究結(jié)果一致，說明侵染我國煙草的病毒主要種類沒有發(fā)生變化。

表1 采集煙草樣品的詳細信息

表2 侵染我國煙草的主要病毒種類及其感染率 （%）

從檢測結(jié)果來看，每種病毒都有疑似侵染，而且疑似侵染率較高。TEV的總侵染率和單侵染率都很低，但疑似侵染率甚至高于總侵染率。疑似侵染檢測結(jié)果的出現(xiàn)，可能是ELISA本身檢測限較高、待測樣品病毒含量較低、操作過程也可能造成一些影響等原因所致。此外，所有檢測樣品中未檢出待測4種病毒（未確定病毒種類）的比例很高。2010年樣品有20.8%未確定病毒種類，2011年樣品未確定種類的更是高達32.2%。造成如此高的未檢出率，推測主要有兩方面的原因，一是樣品無病毒感染，癥狀是由于煙株生理等原因造成；二是說明侵染我國煙草的病毒種類除了TMV，CMV，PVY和TEV 4種外，還存在其他病毒種類。

2.3 我國煙草病毒侵染類型

2.3.1 單一侵染類型

在所有侵染類型中，單侵染類型發(fā)生率最高（表3），2010年單侵染率為49.4%，2011年為45.9%，單侵染率約50%。由于所有樣品中未確定病毒種類的比例很高，因此推測大田病毒病單侵染率應(yīng)該遠高于50%。

在所有樣品中，TMV單侵染率最高（表2），2010和2011年單侵染率分別29.9%和25.1%；其次為CMV，兩年單侵染率分別11.7%和7.1%；再次為PVY，兩年單侵染率分別為1.3%和2.8%；TEV的單侵染率最低，2010年沒有檢測出單侵染，而2011年也只有0.4%，這與TEV總侵染率低有關(guān)。

2.3.2 復(fù)合侵染類型

病毒病大田復(fù)合侵染較為普遍（表4），2種、3種和4種病毒復(fù)合侵染類型均有檢出。共有PVY/TEV，TEV/TMV， TMV/CMV， PVY/TEV/TMV， TEV/TMV/CMV，PVY/TMV/CMV和PVY/TEV/TMV/CMV 7種復(fù)合侵染類型。2010年和2011年，所有樣品復(fù)合侵染率（PVY/TEV，TEV/TMV，TMV/CMV，PVY/TEV/TMV，TEV/TMV/CMV，PVY/TMV/CMV和PVY/TEV/TMV/CMV侵染率之和)分別為34.9%和28.6%。在所有復(fù)合侵染類型中（表3，表4），2種病毒復(fù)合侵染的比例最高，2010和2011年分別為21.4%和17.3%，其中TMV和CMV復(fù)合侵染最為普遍，這兩種病毒兩年復(fù)合侵染率分別為21.4%和15.7%；3種病毒復(fù)合侵染的比例分別為5.2%和3.9%。值得重視的是，2010年和2011年分別有1.3%和0.8%的樣品同時檢測出4種病毒，說明大田煙草病毒病復(fù)合侵染比較嚴重。

表3 不同煙區(qū)煙草病毒感染率 （%）

表4 我國煙草病毒復(fù)合侵染類型及感染率 （%）

2.4 煙草病毒病的發(fā)生情況

不同煙區(qū)煙草病毒病發(fā)生的情況見表3。

云南：作為我國最大的煙草種植區(qū)，TMV和CMV是侵染該省煙草的主要病毒種類，這與劉勇等[18]的研究結(jié)果一致。TMV感染率2010年和2011年分別為38.9%和77.3%，CMV感染率分別為5.6%和15.9%，可以看出2011年云南省煙草上TMV和CMV發(fā)生情況較2010年嚴重。從檢測結(jié)果來看，2010年樣品中不能確定有PVY和TEV兩種病毒侵染，而且2010年只檢測到TMV或CMV單侵染。值得注意的是2010年樣品中有55.6%的樣品沒有確定病毒種類，這是否說明2010年有某種病毒(除檢測4種外)大流行，還有待進一步研究確定。從測定數(shù)據(jù)也可以看出，2010年云南樣品只有單侵染一種類型，2011年樣品發(fā)生單侵染和3種病毒、4種病毒復(fù)合侵染的比例要高于全國平均水平。

貴州：TMV和CMV是貴州煙區(qū)的主要病毒種類，與青玲等[6]的研究結(jié)果一致。2010年貴州省所有樣品均檢出TMV，39.1%的樣品檢出CMV，PVY的檢測率為26.1%，均高于同期全國水平，而且3種病毒和2種病毒復(fù)合侵染率分別為13%和39.1%，也高于同期全國水平。2011年貴州省樣品沒有檢測到PVY和TEV。2010年樣品2種和3種病毒復(fù)合侵染率高于全國平均水平，2011年樣品沒有檢出3種和4種病毒復(fù)合侵染的類型。

河南：2010年河南省樣品CMV的感染率最高，為52.9%，其次為TMV，感染率為44.1%，TEV感染率為11.8%，發(fā)生情況較為嚴重。說明2010年侵染河南煙草的病毒以CMV和TMV為主。2011年CMV侵染率為17.6%，在檢測的4種病毒中侵染率最高，但有76.5%的樣品未確定病毒種類，這一比例遠高于CMV，說明存在某種或幾種病毒大流行的可能。2011年的樣品未檢出TEV。

福建：福建省兩年的樣品均只檢出TMV和TEV感染，并且兩年TMV的感染率都為86.7%。2011年所有樣品只有單侵染類型，這一比例2010年也高達93.3%，遠遠高于全國平均水平。說明福建省煙草病毒以單侵染為主，TMV是福建省的主要病毒種類，與陳順輝[17]、劉勇[18]等的研究結(jié)論一致。

湖南：2010年湖南樣品只檢出TMV和CMV兩種病毒，而且CMV的感染率遠高于TMV，該年沒有檢出復(fù)合侵染。2011年樣品TMV侵染率最高，TEV和CMV侵染率相同，該年TEV發(fā)生較為嚴重。兩年檢測結(jié)果與劉勇[18]、巢進[22]等的研究結(jié)論稍有不同。2010年41.2%的樣品沒有確定病毒種類，2011年這一比例高達52.4%，說明可能存在檢測病毒種類外的病毒種類，而且這種病毒有上升趨勢。

湖北：2010年湖北樣品只檢測出TMV感染，但CMV疑似感率為33.3%。2011年樣品中TMV和CMV檢出率最高。TMV和CMV是危害湖北煙草的主要病毒種類。2011年樣品病毒復(fù)合感染率高于全國平均水平，復(fù)合侵染較為嚴重。

山東：山東省兩年的樣品都只檢測出TMV和CMV兩種病毒。2010年TMV侵染率最高，為50.0%，CMV侵染率為25.0%。2011年TMV侵染率為12.5%，CMV為31.3%。值得注意的是，2010年樣品只有單侵染，2011年有62.5%樣品未確定病原種類。

陜西：2010年陜西樣品TMV感染率最高，為78.6%，其次為PVY，感染率為50%，沒有檢測出TEV。2011年CMV的危害上升，感染率最高，感染率為47.1%，TMV感染率有所下降。這兩年的樣品中均沒有檢測出4種病毒復(fù)合侵染的類型。

安徽：TMV和CMV是危害安徽煙區(qū)的主要病毒種類。2010年安徽樣品TMV和CMV的感染率高達100%和90.9%，感染率遠高于全國同期平均水平。對于不同侵染類型，單侵染的比例只有9.1%，而復(fù)合感染率均高于全國平均水平，4種病毒的復(fù)合感染率更是高達18.2%，病毒復(fù)合侵染嚴重。2011年樣品TMV和CMV的感染率也高于同期全國平均水平。

遼寧：2010年遼寧省樣品只有兩個。2011年樣品TMV感染率最高，為46.7%。CMV和PVY的感染率均為40%，高于全國平均水平。

廣西、黑龍江、浙江新昌等煙區(qū)樣品太少，結(jié)果不具有代表性。

3 結(jié)論與討論

（1）TMV和CMV是侵染我國煙草的主要病毒種類，PVY為次要病毒病害，TEV危害較小。

（2）有些煙區(qū)，如湖北、云南、貴州等不同年份主要病毒種類和復(fù)合侵染類型不同，說明不同年份病毒病流行情況不同。

（3）許多樣品沒有確定病毒種類。如2011年河南就有高達76.5%的樣品未確定種類。可能原因一是采集的樣品無病毒感染，癥狀由生理原因產(chǎn)生；二是檢測的病毒種類太少，還存在其他病毒感染。因此，為了全面反映我國煙草病毒病的發(fā)生現(xiàn)狀，尚需要增加待測病毒范圍。

（4）檢測結(jié)果中存在許多疑似感染，如2010年湖北省就有33.3%的樣品為疑似CMV感染，說明ELISA檢測方法還需要進一步優(yōu)化，以提高靈敏度，增加準(zhǔn)確性，降低疑似感染率。

（5）一些煙區(qū)如河南、湖南和山東，兩年未確定病毒種類的樣品比例都很高，由此可推測有其它病毒在流行，而且呈加重趨勢，需要對這3個煙區(qū)進行重點監(jiān)控。

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