復(fù)合生物保鮮劑在冷卻肉保鮮中的應(yīng)用

韓晉輝，翟培，*，孫勇民

（1.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院，廣東廣州510520；2.天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學(xué)院，天津300350）

復(fù)合生物保鮮劑在冷卻肉保鮮中的應(yīng)用

韓晉輝1，翟培1，*，孫勇民2

（1.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院，廣東廣州510520；2.天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學(xué)院，天津300350）

具有抗菌作用的合成多肽與茶多酚制成復(fù)合生物保鮮劑，通過涂抹于冷鮮肉表面研究其保鮮作用。測定復(fù)合保鮮劑處理后冷卻肉的揮發(fā)性鹽基氮以及感官指標后發(fā)現(xiàn)，復(fù)合生物保鮮劑可以有效延長冷卻肉在0℃～4℃條件下的貯藏時間，保鮮時間達到15 d以上。

合成肽；復(fù)合保鮮劑；冷卻肉

Abstract:Synthetic peptide with antimicrobial activity and tea polyphenol made from bio-preservative for the preservation of chilled pork.Detected TVB-N value,sensory quality of chilled pork.The results showed that compound bio-preservative can increase the freshness and shelf life of chilled pork,shelf life could extend to 15 d at 0℃-4℃.

Key words：synthetic peptide;preservative compound;chilled pork

冷卻肉在生產(chǎn)、銷售中要求始終處于0℃～4℃條件下，此時大多數(shù)微生物的生長繁殖被抑制，可以確保肉的安全衛(wèi)生，但并不能完全抑制所有微生物的生長繁殖，一些嗜冷菌，如單核細胞李斯特增生菌（Listeria monocytogenes）和假單胞菌屬（Pseudomonas）等，在冷藏條件下仍然會大量生長和繁殖，最終導(dǎo)致冷卻肉發(fā)生腐敗變質(zhì)[1]。冷卻肉的表面褐變是冷卻肉在銷售過程中常出現(xiàn)的另一類問題，在冷卻肉的貨架期內(nèi)應(yīng)使腐敗變質(zhì)和表面褐變控制到最低程度，目前這兩方面的問題已經(jīng)成為限制冷卻肉大力推廣和普及的主要障礙[2]。冷卻肉的腐敗主要是由于微生物繁殖到一定程度后會分泌蛋白酶，使蛋白質(zhì)分解為多肽和氨基酸，有的氨基酸進一步被分解為硫化氫、吲哚、甲基吲哚和甲胺等有惡臭的物質(zhì)，并且有毒性；褐變主要原因是脂肪被氧化，產(chǎn)生過氧化物，促進肌紅蛋白變色，最終使生肉表面失去光澤，發(fā)黏，并產(chǎn)生腐敗臭氣，甚至長霉。

目前，食品產(chǎn)業(yè)應(yīng)用最廣泛的保鮮劑是化學(xué)保鮮劑。用化學(xué)保鮮劑處理能快速抑制冷卻肉表面的腐敗菌，顯著延長產(chǎn)品保質(zhì)期。但有些化學(xué)保鮮劑會影響冷卻肉的外觀，如肉色色澤變淡、汁液流失等問題。一些化學(xué)合成防腐劑過量使用對人體是有害的,許多國家的食品衛(wèi)生標準都規(guī)定了最大允許使用量。隨著人們對食品安全的重視，越來越多的研究著力于相對化學(xué)保鮮劑更加安全環(huán)保的生物保鮮劑，生物保鮮劑極有可能代替化學(xué)保鮮劑。本實驗所用合成多肽是根據(jù)天蠶素類抗菌肽的保守序列，通過生物信息學(xué)設(shè)計出的全新多肽。利用合成多肽與抗氧化物質(zhì)茶多酚組成復(fù)合保鮮劑，對冷卻肉的保鮮效果進行研究，期望取得冷卻肉保鮮方法的新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

供試金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）為廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院實驗實訓(xùn)中心保存。

1.1.2 主要試劑

多肽AMP-D：上海肽仕生物科技有限公司合成；營養(yǎng)肉湯、PBS緩沖液、無水乙醇、茶多酚（符合食品添加劑標準）等。

1.1.3 主要儀器

DNM9602酶標儀：北京普朗新技術(shù)有限公司；FA2004分析天平：上海舜宇恒平科學(xué)儀器公司；SB-5200DTN超聲波清洗儀：上海益聯(lián)科教設(shè)備有限公司；GI6-2烘箱：常熟市雙杰測試儀器廠；LX-B75L滅菌鍋：廣州市予華儀器有限公司；LRH-150生化培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺：上海比朗儀器有限公司；96孔板等。

1.2 方法

1.2.1 抑菌活性測定和最低抑菌濃度（MIC）的測定

將0.1mg/mL的合成多肽溶液倍比稀釋，當(dāng)金黃色葡萄球菌培養(yǎng)至對數(shù)期(濃度為106cfu/mL~107cfu/mL）后，向96孔板中加入 150 μL菌懸液、30 μL不同濃度的合成多肽，然后放入37℃，100 r/min搖床中培養(yǎng)，待培養(yǎng)24 h后，每孔分別加入20 μL 0.2%2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC），37℃100 r/min避光培養(yǎng)4 h后，觀察其顏色變化，以無水乙醇為對照組[3]。

1.2.2 熱處理對抑菌活性的影響

將合成多肽溶液置于不同溫度的水浴中（40、50、60、70、80℃）加熱15min。分別向96孔板中加入150μL菌懸液（菌濃度為106cfu/mL~107cfu/mL）以及加熱后合成多肽 30 μL（濃度為 0.1 mg/mL），放入 37℃，100 r/min搖床中培養(yǎng)，待培養(yǎng)24 h后，每孔分別加入20 μL 0.2%2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC），37℃ 100 r/min避光培養(yǎng)4 h，酶標儀測定578 nm處吸光值。

1.2.3 揮發(fā)性鹽基氮的測定

將濃度為0.05 mg/mL的合成多肽溶液與0.1%茶多酚溶液按照1∶1比例混合，制成復(fù)合保鮮劑，將溶液涂抹于冷鮮肉表面，用保鮮膜包裹置于0℃～4℃下冷藏17 d，根據(jù)揮發(fā)性鹽基氮的測定原理，按照GB5009.44－2003《肉與肉制品衛(wèi)生標準的分析方法》中微量擴散法對樣品和空白每日分別進行測定。

1.2.4 復(fù)合保鮮劑處理后的感官檢測

復(fù)合保鮮劑涂抹于冷鮮肉表面，用保鮮膜包裹標記，置于4℃冷藏，并每間隔一天進行一次感官評定。感官評定標準根據(jù)GB 2707-94《豬肉衛(wèi)生標準》執(zhí)行，由5名評價員進行打分，結(jié)果取平均值，評定指標見表1。

表1 感官指標評價表Table 1 Sensory evaluation standards for chilled pork

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌活性測定和最低抑菌濃度（MIC）的測定結(jié)果

合成多肽是以天蠶素類抗菌肽為基礎(chǔ)，人工設(shè)計出的一種抗菌肽，經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn)，合成多肽對革蘭氏陽性菌有明顯的殺滅作用，多肽序列如下：KIGKKLEGVG KRVAVISDSHAKRLVGQAAALAK[4]。TTC是一種活菌染料，其氧化態(tài)是無色的，該染料進入細胞后，TTC和活細胞內(nèi)的琥珀酸脫氫酶反應(yīng)，生成紅色的還原產(chǎn)物甲臜。抑菌活性測定和最低抑菌濃度（MIC）的測定結(jié)果見表2。

表2 合成肽對金黃色葡萄球菌MIC測定結(jié)果Table 2 The result of MIC polypeptide against Listeria monocytogenes

從表2可以看出，經(jīng)TTC染色后，培養(yǎng)基的顏色隨合成多肽濃度的增加而變淺，直至無色。表明合成多肽可抑制金黃色葡萄球菌的生長，且抑制作用隨多肽濃度的增加而增強。當(dāng)合成多肽的濃度大于0.07 mg/mL（終濃度為：10.5 μg/mL）時，即可完全抑制金黃色葡萄球菌的生長，故其對金黃色葡萄球菌的MIC為 10.5 μg/mL。

2.2 熱處理對抑菌活性的影響

不同溫度處理后的多肽加入到菌液中，37℃培養(yǎng)24 h后，加入TTC溶液，在578 nm處測吸光值[5]。多肽熱處理后對抑菌活性的影響見圖1。

由圖1可以看出，在加熱溫度小于60℃時，溫度對多肽抑菌活性影響不大，隨著溫度增加，多肽活性逐漸減弱。由此實驗可以看出合成多肽具有一定的耐熱性，具有良好的加工特性。這可能與多肽的二級結(jié)構(gòu)有關(guān)系，合成多肽的二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋結(jié)構(gòu)為主，結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定，因此對加熱不是十分敏感。

2.3 揮發(fā)性鹽基氮的測定

按照GB 5009.44－2003《肉與肉制品衛(wèi)生標準的分析方法》揮發(fā)性鹽基氮評價標準：一級鮮肉15 mg/100 g以下；二級鮮肉20 mg/100 g以下；變質(zhì)肉20 mg/100 g以上。本實驗采用GB 5009.44－2003中揮發(fā)性鹽基氮的測定方法，測定結(jié)果見圖2。

由圖2可以看出，空白組在0℃～4℃儲藏過程中TVB-N值上升較快，11 d時TVB-N值已經(jīng)超過20 mg/100 g，即冷卻肉已經(jīng)腐?。唤?jīng)過多肽溶液涂膜以后的冷卻肉貯藏時間明顯比空白組延長，第17天測定TVB-N值時仍然小于20 mg/100 g。由此可見，多肽溶液可以明顯阻止微生物的繁殖，從而有效延長了冷卻肉的貨架期。

2.4 復(fù)合保鮮劑對冷鮮肉感官指標的影響

茶多酚溶液顏色較深，為了不影響冷卻肉的外觀，使用時溶液濃度較低，終濃度僅為0.05%，但在抗氧化方面起到了較好的效果。根據(jù)GB 2707-94《豬肉衛(wèi)生標準》執(zhí)行標準，5名評價員打分結(jié)果見表3。

表3 0℃～4℃條件下肉樣感官指標綜合評分結(jié)果Table 3 Result of sensory quality score of chilled pork at 0℃-4℃

由表3可以看出，未經(jīng)復(fù)合保鮮劑處理的冷卻肉在第9天時綜合評分為3分，感官指標顯著低于處理后冷卻肉的感官評價值。經(jīng)復(fù)合保鮮劑處理的冷卻肉在第15天時感官評價值仍然達到鮮肉的評分范圍，可見復(fù)合保鮮劑可以有效延長冷卻肉的保藏期限。

3 結(jié)論

合成多肽對革蘭氏陽性菌有較好的抑制和殺滅作用，包括對嗜冷菌單核細胞李斯特增生菌（Listeria monocytogenes）等多種微生物，因此合成多肽與茶多酚組成的復(fù)合保鮮劑可以起到顯著的保鮮作用，在0℃～4℃條件下，冷卻肉的保鮮時限可以達到15 d以上。由于合成多肽對革蘭氏陰性菌和真菌沒有抑制作用，對冷卻肉保鮮時限的進一步延長有望通過合成多肽與其它抑制陰性菌的保鮮物質(zhì)共同作用實現(xiàn)。

[1]盧士玲,李開雄,徐幸蓮.不同生物保鮮劑對冷鮮肉抑菌效果的研究進展[J].肉類研究,2008(2):38-41

[2]何曉燕,蔣其斌,夏天蘭,等.不同濃度茶多酚對冷卻肉的影響分析[J].食品工業(yè)科技,2010,31(6):81-83

[3]王倩,謝明杰.木犀草素對金黃色葡萄球菌的抑菌活性及其機制[J].微生物學(xué)報,2010,50(9):1180-1184

[4]韓晉輝,翟培.天蠶素類抗菌肽的結(jié)構(gòu)設(shè)計及活性預(yù)測[J].農(nóng)產(chǎn)品加工(學(xué)刊),2011(2):32-35

[5]吳窈畫,談書華,范超超,等.MTT法檢測細菌細胞數(shù)的主要影響因素分析[J].微生物學(xué)雜志,2011,21(3):67-71

Application of Composite Biological Preservation of Chilled Pork

HAN Jin-hui1,ZHAI Pei1,*，SUN Yong-min2
（1.Guangdong Food and Drug Vocational College,Guangzhou 510520,Guangdong,China;2.Tianjin Modern Vocational Technology College,Tianjin 300350,China）

2011-11-27

廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院院級資助課題（2009YZ003）

韓晉輝（1979—），男（漢），實驗師，碩士，研究方向：營養(yǎng)與生物技術(shù)。

*通信作者：翟培（1980—），女，講師。