高效表達(dá)L-乳酸的釀酒酵母工程菌構(gòu)建研究

吳曉燕，張光一

（1.河北省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，河北石家莊 050051；2.河北經(jīng)貿(mào)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊050061）

高效表達(dá)L-乳酸的釀酒酵母工程菌構(gòu)建研究

吳曉燕1，張光一2，*

（1.河北省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，河北石家莊 050051；2.河北經(jīng)貿(mào)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊050061）

采用基因工程方法和進(jìn)化工程相結(jié)合的策略對(duì)釀酒酵母進(jìn)行遺傳改造，獲得高效表達(dá)L-乳酸的釀酒酵母適應(yīng)工程菌。以酵母丙酮酸脫羧酶基因1為同源序列構(gòu)建乳酸脫氫酶編碼基因整合片段，并與酵母自主表達(dá)質(zhì)粒pUT332共轉(zhuǎn)化釀酒酵母菌，篩選具有乳酸脫氫酶活性的轉(zhuǎn)化子。再通過進(jìn)一步適應(yīng)進(jìn)化篩選高產(chǎn)乳酸的釀酒酵母工程菌。結(jié)果表明，工程菌的培養(yǎng)介質(zhì)組成（g/L）為糖蜜總糖120、玉米黃漿水1000、K2HPO46，起始pH 5.0；發(fā)酵條件為發(fā)酵時(shí)間4 d，接種量10%，攪拌速度650 r/min，通氣量1.5 L/min，發(fā)酵溫度30℃。

L-乳酸；適應(yīng)進(jìn)化；遺傳改造；農(nóng)副產(chǎn)品；環(huán)境友好

Abstract:An engineered Saccharomyces cerevise strain was constructed by genetic engineering and evolution method.First,construct the integrated chimeric fragment of lactic dehydrogenase(LDH)using yeast pyruvate decarboxylase 1 gene as the homologous integrative site,then co-transform the fragment into the S.cerevise with yeast episomal plasmid pUT332 and select the transformants with LDH activity.Further screen was carried out by adaptive evolution method and obtain the interest strain which grows quickly and secrets L-lactic acid efficiently.The optimized culture media composition(g/L)was molasses 120,corn paste waste water 1000,K2HPO46,pH 5.0.The optimized fermentation parameters are as follow,fermentation time 4 d，inoculating rate 10%，stirring rate 650 r/min，aeration rate 1.5 L/min，fermentation temperature 30 ℃。

Key words：L-lactic acid;adaptive evolution;genetic modification;agricultural by-products;environmentfriendly

L-乳酸作為高科技含量的生物制品，不僅在化學(xué)工業(yè)中得到廣泛應(yīng)用，而且已被廣泛應(yīng)用于食品飼料、醫(yī)藥、化妝品生產(chǎn)，市場(chǎng)潛力很大。用釀酒酵母發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸，生產(chǎn)工藝簡化、可持續(xù)性好，利于環(huán)境保護(hù)，降低加工成本，更好地滿足聚乳酸生產(chǎn)要求，有廣闊的發(fā)展前景。Nobuhiro Ishida[1]等通過在染色體整合牛乳酸脫氫酶基因，構(gòu)建有效產(chǎn)生L-乳酸的釀酒酵母菌，產(chǎn)量可達(dá)55.6 g/L。Satoshi Saitoh[2]等將6拷貝牛乳酸脫氫酶基因整合在葡萄酒酵母染色體上構(gòu)建高產(chǎn)乳酸菌株，并以甘蔗汁作培養(yǎng)介質(zhì)，乳酸產(chǎn)量高達(dá)122 g/L。光學(xué)純度達(dá)99.9%。Danilo Porro等[3]將牛的L-乳酸脫氫酶基因在丙酮酸脫羧酶基因突變的Kluyveromyces lactis中表達(dá)，使乳酸產(chǎn)量達(dá)到109 g/L，轉(zhuǎn)基因K.lactis菌株大大改進(jìn)分批補(bǔ)料發(fā)酵條件下產(chǎn)量。國內(nèi)未見酒酵母高效表達(dá)L-乳酸的系統(tǒng)研究報(bào)道。

以農(nóng)副產(chǎn)品為原料進(jìn)行深加工、生產(chǎn)L-乳酸產(chǎn)品，提高農(nóng)副產(chǎn)品的附加值，提高乳酸生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益，又有利于環(huán)境保護(hù)，減少廢物的排放，促進(jìn)社會(huì)的可持續(xù)發(fā)展。為了使釀酒酵母有效地產(chǎn)生乳酸，本研究借助丙酮酸脫羧酶編碼基因的啟動(dòng)子，將乳酸脫氫酶基因整合在酵母染色體上，并結(jié)合適應(yīng)進(jìn)化技術(shù)獲得釀酒酵母工程菌。并采用農(nóng)副產(chǎn)品或副產(chǎn)物作為發(fā)酵介質(zhì)，對(duì)構(gòu)建高產(chǎn)L-乳酸、菌體生長旺盛的釀酒酵母菌株進(jìn)行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 菌株和載體

大腸桿菌（E.coli）DH5α用于基因克隆。工業(yè)釀酒酵母菌為本研究室保存，作為出發(fā)菌株。各種質(zhì)粒為本研究室保存，質(zhì)粒在大腸桿菌中選擇標(biāo)記為氨芐青霉素抗性（Ampr）。酵母自主表達(dá)質(zhì)粒pUT332攜帶腐草霉素抗性基因[4]。所用酵母在30℃培養(yǎng)，在4℃麥汁斜面保存。

1.2 培養(yǎng)基

LA培養(yǎng)基：大腸桿菌生長培養(yǎng)基LB（0.5%酵母粉、1%蛋白胨、1%氯化鈉），根據(jù)需要添加氨芐青霉素（濃度為50 μg/mL），用于質(zhì)粒擴(kuò)增。酵母生長復(fù)合培養(yǎng)基（YEPD）：1%酵母粉、2%蛋白胨、2%葡萄糖，瓊脂2%。YNB培養(yǎng)基:YNB 6.7 g/L，葡萄糖2%。含腐草霉素250 μg/mL，用于酵母菌轉(zhuǎn)化子篩選。

1.3 酶和試劑

限制性內(nèi)切酶、Pfu DNA聚合酶、T4DNA連接酶為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。小牛胸腺DNA及其它分子生物學(xué)試劑為Sigma公司產(chǎn)品。引物由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.4 儀器

RS-1型渦旋振蕩器：北京鼎昊源科技有限公司；Gene PulserTM電轉(zhuǎn)儀：美國Bio-rad公司；Mini-BeadBeater-1小型珠磨式組織研磨器：美國BioSpec公司；BLBIO-5GJ發(fā)酵罐：德國B.Braun生物技術(shù)公司；惠普-1100型高效液相色譜儀、HP5890氣相色譜儀：美國Agilent公司。

1.5 細(xì)胞破碎液制備[5]

3000 r/min離心5 min收集1×109細(xì)胞，首先用pH 7的100mmol/L的KH2PO4洗，然后用pH7的10mmol/L的KH2PO4洗。取100 mg（濕重）酵母細(xì)胞加1 g直徑0.5 mm玻璃珠、0.5 mL pH 7的50 mmol/L的KH2PO4（含1 mmol/L MDDT和2 mmol/L MgCl2）的混合液洗。試管在渦旋振蕩器中振蕩1 min，冰浴1 min，重復(fù)5次。然后13000 r/min離心1 min，收集上清液。

1.6 目的基因PCR

根據(jù) GenBank（accession number Z81318）報(bào)導(dǎo)的瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）的乳酸脫氫酶基因L-LDH基因序列設(shè)計(jì)引物。引物1：5'-gcggatccagg agatttattgtt-3'，引物 2：5'-ctggtaccgaaaagagatgctc-3'。其5'端有BamHI酶切位點(diǎn)，3'端有KpnI酶切位點(diǎn)。按下面條件PCR，獲得L-乳酸脫氫酶基因，大小1 kb。

根據(jù) GenBank（accession number X04675）報(bào)導(dǎo)的釀酒酵母基因組丙酮酸脫羧酶基因?yàn)槟０逶O(shè)計(jì)引物。編碼序列上游序列3：5'-atatatgaattcgcgtttatttacctatctt-3',4：5'-atatatggatcctttgattgatttgactgtg-3',其 5'端 有EcoRI酶切位點(diǎn)，3'端有BamHI酶切位點(diǎn)。編碼序列的下游序列 5：5'-atataggtcgacttgaacgtcccagctaagttg-3',6：5'-atatattctagactcgtcagcaatagtggtcaac-3'，其 5'端有SalI酶切位點(diǎn)，3'端有XbaI酶切位點(diǎn)。按下列條件進(jìn)行PCR，獲得丙酮酸脫羧酶1的部分啟動(dòng)子序列和編碼序列的下游序列。

PCR 體系組成（50 μL）：模板1 μL；E.Master酶混合物 25 μL；引物 2 μL×2；重蒸水加至 50 μL。

參數(shù)：

1.7 酵母轉(zhuǎn)化

酵母細(xì)胞經(jīng)10 mL YEPD培養(yǎng)基30℃過夜培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)接500 mL YEPD培養(yǎng)液（2 L三角瓶）搖床培養(yǎng)至OD600=1.3~1.5。4℃，4000r/min收集細(xì)胞重懸于80mL重蒸無菌水，添加10mLpH7.5的10×TE緩沖液、10mL 1 mol/L LiAc，30℃低速振蕩45 min；再加2.5 mL新配制的1 mol/L的DTT，溫浴15 min。酵母懸液用重蒸水稀釋至500 mL，洗3次。細(xì)胞重懸于250 mL冰冷的重蒸水，再懸于30 mL冰冷的1 mol/L山梨醇。收集細(xì)胞并重懸于0.5 mL冰冷的1 mol/L山梨醇中，調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液 OD600=200。向 1.5 mL 離心管添加 40 μL 細(xì)胞，5 μL DNA（線性 DNA：質(zhì)粒 DNA=10∶1，最好是 50ngpUT332）。細(xì)胞-DNA混合物轉(zhuǎn)入帶帽的0.2 cm冰浴電轉(zhuǎn)移管進(jìn)行電脈沖處理（1.5 kV，25 mF and 200 ohms），然后立即加入1 mL冰冷的YEPD培養(yǎng)基，30℃輕微振動(dòng)2 h~4 h。取250 μL涂含腐草霉素的轉(zhuǎn)化平板，30℃培養(yǎng)3 d~4 d。

1.8 適應(yīng)進(jìn)化實(shí)驗(yàn)

保藏菌株涂基本培養(yǎng)基平板，選單菌落接種5 mL液體試管，30℃搖床（40 r/min）培養(yǎng)過夜，然后轉(zhuǎn)接250mL三角瓶，其工作量50 mL，30℃40 r/min搖床培養(yǎng)3 d。轉(zhuǎn)接培養(yǎng)7 d。培養(yǎng)細(xì)胞重復(fù)上面步驟，碳源或鹽濃度增加。培養(yǎng)介質(zhì)定期更新（3.5 d更新一次），共12次。培養(yǎng)液葡萄糖濃度為20%~30%。碳酸鈉濃度為3%~5%。培養(yǎng)40多天后，取5 mL轉(zhuǎn)接50 mL培養(yǎng)液培養(yǎng)，再轉(zhuǎn)接1.0 L YNB介質(zhì)，（含葡萄糖300 g/L或碳酸鈉5 g/L，發(fā)酵1 d。培養(yǎng)物涂平板，挑單菌落依次轉(zhuǎn)接如上5 mL、50 mL、1.0 LYNB介質(zhì)（含葡萄糖300 g/L或碳酸鈉50g/L），發(fā)酵16h。第3次重復(fù)上述步驟發(fā)酵13 h。最后收集細(xì)胞涂平板。用乳酸調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH<4.6。篩選生長旺盛的適應(yīng)菌株。

1.9 乳酸脫氫酶測(cè)定

YEPD培養(yǎng)基培養(yǎng)，將對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞（OD600=0.8）轉(zhuǎn)至含0.9 mol/L NaCl的YEPD培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)2 h。離心收集細(xì)胞，用等滲鹽溶液洗2次，置于沸騰的乳酸脫氫酶LDH提取緩沖液（0.1 mol/L Mops，pH 7.2，10%甘油,1 mmol/L二硫蘇糖醇），然后酵母用小型珠磨式組織研磨器破碎細(xì)胞，添加0.5-mm zirconia-silica珠，然后4℃13000 r/min離心15 min除去細(xì)胞碎片，上清液用于乳酸脫氫酶活性測(cè)定。

在磷酸緩沖液（73 mmol/L KH2PO4，3.5 mmol/L Na2HPO4，pH 5.6）添加1 mmol/L丙酮酸和0.2 mmol/L NADH，25℃分光光度法測(cè)定乳酸脫氫酶活性。酶活性定義為在反應(yīng)條件下，1 min將1 mmol/L底物還原為乳酸所需的酶量。蛋白質(zhì)含量用考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定，以牛血清蛋白作為測(cè)定參照標(biāo)準(zhǔn)。

1.10 發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

儲(chǔ)存菌株培養(yǎng)物2mL接種250mL三角瓶（100mL YEPD培養(yǎng)介質(zhì)），30℃150 r/min搖瓶培養(yǎng)至平衡期作為種子培養(yǎng)物。發(fā)酵采用合成培養(yǎng)基，發(fā)酵罐裝有3 L培養(yǎng)介質(zhì)，121℃滅菌40 min。發(fā)酵罐接種量為1.0×107個(gè)/mL~1.5×107個(gè)/mL，轉(zhuǎn)速 650 r/min?？刂仆饬?.5 L/min，發(fā)酵溫度控制在30℃。如果需要可用10%無菌氨水控制。發(fā)酵6 d，每天取樣測(cè)定發(fā)酵液的pH、細(xì)胞生物量、糖消耗量、乙醇含量和乳酸含量。

1.11 分析方法

乳酸、殘?zhí)怯酶咝б合嗌VHPX-87H（300 mm×7.8 mm）Aminex色譜柱（Bio-Rad）或DNS法測(cè)定。用NucLeosiL 5C-18100A柱。流動(dòng)相為重蒸水，流速1 mL/min。5mmol/LH2SO4作為洗脫液，流速0.5mL/min。乳酸的光學(xué)純度用惠普-1100型高效液相色譜儀測(cè)定。Hypersil ODS（C18）色譜柱（150 mm×2.1 mm i.d，5 μm）；流動(dòng)相：0.65mmol/L2，3，6三甲基β環(huán)糊精（TM－β－CD，含 5 mmol/L H2SO4），pH 2.5；流速：0.5 mL/min；紫外檢測(cè)波長：210 nm；進(jìn)樣量：5 μL；柱溫：室溫。乙醇用氣相色譜測(cè)定，采用火焰離子化檢測(cè)器。取1 μL注入HP5890氣相色譜儀，配備DBWAX大孔柱。載氣為氮?dú)?，流速?0 mL/min。加樣和檢測(cè)溫度分別為240、250℃。爐溫：80℃保持2 min，然后升至200℃，升溫速度10℃/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 乳酸脫氫酶基因整合片段獲得

2.1.1 乳酸脫氫酶基因LDH獲得

將乳酸脫氫酶基因LDH基因引入釀酒酵母，使其可以用另一代謝途徑再生NAD+，糖酵解轉(zhuǎn)向乳酸生成途徑，使胞內(nèi)丙酮酸直接還原為乳酸，導(dǎo)致乙醇和乳酸同時(shí)積累。已經(jīng)證明[6]：瑞士乳桿菌（L.helveticus）乳酸脫氫酶基因LDH可以與酵母的丙酮酸脫羧酶競爭使乙醇生產(chǎn)方向轉(zhuǎn)至乳酸生產(chǎn)方向。故本研究以瑞士乳桿菌基因組為模板，進(jìn)行PCR獲得乳酸脫氫酶基因。

2.1.2 乳酸脫氫酶基因嵌合片段構(gòu)建

將PCR獲得的丙酮酸脫羧酶基因的5'插入pBluescriptM13-的EcoRI/BamHI位點(diǎn),然后再將3'片段插入SalI/XbaI位點(diǎn)。重組載體1經(jīng)BamHI+SalI酶切，與將L.helveticus的L-LDH/BamHI+KpnI基因和乙醇脫氫酶下游3'基因片段/KpnI+SalI一同連接，獲得攜帶5'PDC1+LDH+ADH1T+3'PDC1基因片段的重組載體2。用AatII+XbaI酶切獲得該嵌合片段如圖1，大小約為2.9 kb。

2.2 產(chǎn)乳酸釀酒酵母菌株構(gòu)建

2.2.1 電轉(zhuǎn)化及整合驗(yàn)證

通過電轉(zhuǎn)化法將整合片段與酵母自主表達(dá)質(zhì)粒pUT332轉(zhuǎn)化工業(yè)釀酒酵母菌,在含150 μg/mL腐草霉素的YEPD培養(yǎng)基上篩選陽性轉(zhuǎn)化子。提取轉(zhuǎn)化子基因組進(jìn)行PCR驗(yàn)證，如圖2，以乳酸脫氫酶基因LDH上游引物和PDC1終止序列的下游引物為引物，獲得基因片段為2.1 kb。表明乳酸脫氫酶基因整合在酵母的基因組上，并破壞丙酮酸脫羧酶1基因。

2.2.2 轉(zhuǎn)化子的篩選標(biāo)記丟失培養(yǎng)

對(duì)目標(biāo)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行YEPD非選擇性培養(yǎng)數(shù)代，選擇腐草霉素抗性丟失的菌株進(jìn)一步研究。

2.2.3 轉(zhuǎn)化子初步生長研究

對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行細(xì)胞生長及初步發(fā)酵性能測(cè)試，轉(zhuǎn)化子30℃培養(yǎng)72 h，接種量為10%。測(cè)定L-乳酸產(chǎn)生量最高為48.9 g/L，見圖3。

2.3 轉(zhuǎn)化子適應(yīng)進(jìn)化

研究發(fā)現(xiàn)，在高滲透脅迫條件下，酵母細(xì)胞通過激活不同的機(jī)理合成一些代謝產(chǎn)物并在胞內(nèi)積累滯留，達(dá)到適應(yīng)存活[5]。酵母細(xì)胞中pH越高，生存能力越強(qiáng)，乳酸產(chǎn)量越高。本研究采用高滲脅迫適應(yīng)和低pH適應(yīng)相結(jié)合的篩選策略。

首先采用高糖/高鹽作為選擇條件誘導(dǎo)菌株發(fā)生遺傳改變獲得突變子庫。用30%葡萄糖及5%的碳酸鈉的合成基本培養(yǎng)基進(jìn)行適應(yīng)篩選（40 r/min搖瓶培養(yǎng)），使獲得的重組菌株產(chǎn)生抗脅迫能力，并經(jīng)連續(xù)傳代培養(yǎng)28 d（約200代）的系列轉(zhuǎn)移-稀釋策略，篩選生長旺盛的適應(yīng)菌株60個(gè)；然后用低pH 4.5的合成培養(yǎng)介質(zhì)（用乳酸調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH<4.5）進(jìn)一步適應(yīng)培養(yǎng)，篩選生長旺盛的適應(yīng)菌株30個(gè)。最后，篩選生長旺盛、胞內(nèi)pH高、乳酸產(chǎn)量高的菌株3個(gè)。

2.4 適應(yīng)菌株發(fā)酵優(yōu)化研究

2.4.1 發(fā)酵介質(zhì)組成優(yōu)化

對(duì)糖蜜、玉米黃漿水、尿素比例進(jìn)行研究，采用三因素四水平，按正交表L9（34）設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，30℃250 mL三角瓶（裝瓶量100 mL）搖床培養(yǎng)48 h，確定培養(yǎng)基最佳組成。優(yōu)化培養(yǎng)基組成（g/L）：糖蜜總糖120；玉米黃漿水 1000；K2HPO46。

2.4.2 發(fā)酵條件研究

1）以菌體接種量、培養(yǎng)基初始pH、培養(yǎng)時(shí)間，按正交表L9（34）設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，250 mL三角瓶裝有100 mL培養(yǎng)介質(zhì)30℃200 r/min搖瓶培養(yǎng)，測(cè)定乳酸生成量，確定最適初始發(fā)酵介質(zhì)pH 5.0，接種量1.3 cells/mL×107cells/mL，培養(yǎng) 5 d。

2）采用5-L發(fā)酵罐（BIOSTAT-B,B.Braun,Germany），介質(zhì)填充量3 L，發(fā)酵介質(zhì)初始pH 5.0，接種量1.3×107cells/mL?？刂迫苎?0%~50%，攪拌速度300 r/min~1000r/min，發(fā)酵溫度30℃，發(fā)酵6d。每天取樣測(cè)定發(fā)酵液的pH、細(xì)胞生物量、糖消耗量、乙醇含量和乳酸含量。

確定最佳發(fā)酵條件：發(fā)酵介質(zhì)初始pH 5.0，接種量1.3×107個(gè)/mL，發(fā)酵溫度 30℃，溶氧 30%，攪拌速度650 r/min，發(fā)酵時(shí)間4 d。最終得率：乳酸52.2 g/L，乙醇45.8 g/L；49.2%的糖轉(zhuǎn)化為乳酸，乙醇產(chǎn)生量降低到原來的46.8%。

酵母在不同發(fā)酵時(shí)期的代謝產(chǎn)物見圖4。

3 結(jié)論

聚L-乳酸作為一種非常有吸引力的熱塑性無毒高分子材料，生物相容性好，易與市政環(huán)衛(wèi)管理處理體系結(jié)合，沒有白色污染，滿足社會(huì)可持續(xù)發(fā)展要求。本課題獲得高效表達(dá)L-乳酸的酵母適應(yīng)工程菌，可利用價(jià)格低廉的糖蜜、玉米黃漿水發(fā)酵生產(chǎn)乳酸。發(fā)酵介質(zhì)組成（g/L）：糖蜜120，玉米黃漿水1000，K2HPO46，pH 5.0。最適發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度30℃，裝液量 60%，接種量 1.3×107個(gè)/mL，溶氧 30%，攪拌速度650 r/min，發(fā)酵時(shí)間4 d。構(gòu)建的酵母適應(yīng)工程菌可以用廉價(jià)培養(yǎng)介質(zhì)發(fā)酵生產(chǎn)，生產(chǎn)成本低；引入的乳酸脫氫酶基因整合在酵母染色體上，遺傳穩(wěn)定；沒有引入細(xì)菌來源的抗藥性基因，利于食品應(yīng)用；可以進(jìn)行高密度培養(yǎng)；酵母酸耐受性強(qiáng)，減少發(fā)酵過程中中和劑使用。該酵母適應(yīng)工程菌的乳酸產(chǎn)量比一般乳酸菌低，仍有部分乙醇產(chǎn)生，今后應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行遺傳修飾，提高L-乳酸產(chǎn)量。由于廉價(jià)發(fā)酵介質(zhì)雜質(zhì)多，發(fā)酵后的低成本純化方法選擇具有挑戰(zhàn)性，應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行純化研究，降低純化成本。

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Construction of Commercial Saccharomyces cerevisiae with L-lactic acid Efficient Production Ability

WU Xiao-yan1,ZHANG Guang-yi2,*
（1.Hebei Institute of Product Quality Supervision and Inspection,Shijiazhuang 050051,Hebei,China;2.Bioscience and Bioengineering College,Hebei University of Economics and Business,Shijiazhuang 050061,Hebei,China）

2012-03-25

河北省引進(jìn)留學(xué)人員資助項(xiàng)目（2011226）；河北省社會(huì)科學(xué)發(fā)展研究課題（201103161）

吳曉燕(1964—)，女（漢），副研究員，碩士，研究方向：食品安全與可持續(xù)發(fā)展。

*通信作者：張光一（1964—），男（漢），副教授，碩士，研究方向：食品安全與可持續(xù)發(fā)展。