響應面法優(yōu)化樟芝真菌發(fā)酵培養(yǎng)條件研究

孫素華，孫金旭，朱會霞，鞏建英，劉艷立

（1.衡水學院，河北衡水053000；2.衡水中學，河北衡水053000）

響應面法優(yōu)化樟芝真菌發(fā)酵培養(yǎng)條件研究

孫素華1，孫金旭1，朱會霞1，鞏建英2，劉艷立1

（1.衡水學院，河北衡水053000；2.衡水中學，河北衡水053000）

借助于SAS8.0軟件，對樟芝真菌進行發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化研究。首先利用Plackett Burman試驗設計篩選出影響樟芝真菌發(fā)酵的3個主要因素，即接種量、培養(yǎng)溫度和葡萄糖添加量。在此基礎上用最陡爬坡路徑逼近最大響應區(qū)域，再利用Box-Behnken試驗設計及響應面分析法進行回歸分析。結果表明，接種量與樟芝菌體產(chǎn)量存在極顯著的相關性，通過求解回歸方程得到優(yōu)化主要發(fā)酵條件，接種量15%、培養(yǎng)溫度26.1℃、葡萄糖添加量3.9%。經(jīng)培養(yǎng)驗證，預測值與驗證試驗平均值接近，此優(yōu)化條件下樟芝菌體產(chǎn)量可達到7.06 g/L。

樟芝真菌；發(fā)酵；生物量；響應面

Abstract:With SAS8.0 software,the use of Plackett-Burman experimental design method and response surface method analysis of a fermentation of antrodia camphorata.Optimization of process conditions.First of all,the use of Plackett Burman screening experimental design affect antrodia camphorata production three main factors,namely,inoculum size,incubation temperature and glucose addition.On this basis the most steep climbing path in response to approaching the largest region,re-use Box-Behnken experimental design and response surface method for regression analysis.The results showed that inoculum antrodia camphorata production and the existence of significant relevance,by solving the regression equation had been optimized main fermentation conditions.They were inoculum 15%,culture temperature 26.1℃,the volume of 3.9%glucose added.By cultivating authentication and verification test predictive value close to the average,the optimum conditions can be achieved antrodia camphorata yield 7.06 g/L.

Key words：antrodia camphorata；fermenting；biomass；RSM

樟芝的化學成分非常復雜，現(xiàn)代分離技術證實，樟芝含有防癌，抗癌，提高免疫力的生理活性物質(zhì)的主要成分為多糖體和三萜類化合物[1]。樟芝多糖提中主要含有β-D-葡聚糖，它能夠通過刺激巨嗜細胞，T淋巴細胞，B淋巴細胞等增強人體免疫功能，進而達到抗腫瘤的效果。由于樟芝是臺灣特有的種，惟一的寄主是牛樟樹[2]，隨著科技的發(fā)展，應用的范圍不斷擴大，需求量急劇上升。目前人工的子實體栽培比較困難，采用生物技術方法利用液體發(fā)酵培養(yǎng)樟芝菌絲體，并利用發(fā)酵液提取樟芝多糖是目前最經(jīng)濟，最符合環(huán)保的方法[3]。本文根據(jù)樟芝真菌的生長特點，利用SAS8.0數(shù)據(jù)處理軟件，以菌體為目的產(chǎn)物，對樟芝真菌發(fā)酵條件進行優(yōu)化研究。

1 材料和方法

1.1 菌株

樟芝真菌：衡水學院生命科學系微生物實驗室保藏。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基（g/L）：馬鈴薯200.0，葡萄糖20.0，MgSO4·7H2O 1.5，KH2PO43.0，VB10.01，瓊脂 20.0，20%的土豆汁配制。

種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖30.0，黃豆粉10.0，酵母膏 1.0，MgSO4·7H2O 0.5，KH2PO41.0，VB10.01，pH 8.0，蒸餾水配制。

發(fā)酵培養(yǎng)基：碳源為葡萄糖3.8%，氮源為蛋白胨0.4%，pH8.0，酵母膏

1.3 培養(yǎng)方法

1.3.1 種子液的培養(yǎng)

從25℃下培養(yǎng)8 d的斜面上用接種鏟切1 cm2帶培養(yǎng)基的菌體轉(zhuǎn)入裝有150 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，25℃、150 r/min培養(yǎng)3 d。

1.3.2 發(fā)酵培養(yǎng)

將種子以一定的接種量，接入裝有一定量培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，在25℃培養(yǎng)溫度下、振蕩培養(yǎng)8d。

1.4 檢測方法

1.4.1 生物量菌體干重的測定

取一定量的發(fā)酵液，用已烘干并稱重的濾紙過濾,用水沖洗至洗液不再帶有發(fā)酵液顏色為止。在80℃恒溫的烘箱中烘至恒重,在干燥器中冷卻至常溫,稱重。

3500 r/min離心15 min，棄上清液，菌體用蒸餾水洗滌至無發(fā)酵液顏色，60℃烘干至恒重。稱重。

1.4.2 樟芝多糖的定量檢測

本研究采用苯酚—硫酸法。

1.5 Plackett-Burman設計篩選樟芝發(fā)酵條件的重要因素

Plackett-Burman（PB）設計法是一種兩水平的實驗設計方法，它試圖用最少的試驗次數(shù)達到使因素的盡可能精確的估計，適用于從眾多的考察因素中快速有效地篩選出最為重要的幾個因素供進一步研究[4]，根據(jù)樟芝所需營養(yǎng)要素和發(fā)酵影響因素的一般規(guī)律，結合相關的文獻報道和筆者的前期實驗，本試驗選用實驗次數(shù)N=12的實驗設計，對接種量（X1）、培養(yǎng)溫度（X2）、葡萄糖用量（X3）、酵母膏（X4）、蛋白胨（X5）、KH2PO4（X6）、搖瓶轉(zhuǎn)速（X7）、搖瓶裝液量（X8）8個因素進行考察，分別對應于表中的8列，每個因素取兩個水平，響應值為樟芝菌體產(chǎn)量（Y）。對實驗結果進行分析，得出各因素的t值和可信度水平。一般選擇可信度大于90%以上的因素作為重要因素。

1.5.1 Plackett-Burman設計因素水平表

Plackett-Burman設計因素水平表，如表1所示。

表1 Plackett-Burman設計因素水平表Table 1 The level of Plackett-Burman design factors

1.5.2 響應面分析實驗設計優(yōu)化樟芝發(fā)酵條件

本實驗采用Box-Benhnken實驗設計對樟芝發(fā)酵條件進行3因素3水平的響應面分析實驗，包括12個析因試驗和3個中心試驗。實驗設計如表2所示。

表2 響應面實驗因素水平表Table 2 Levels of the variables in the Box-Behnken design

2 結果與討論

2.1 Plackett-Burman設計篩選樟芝發(fā)酵條件的重要因素

根據(jù)樟芝生長所需營養(yǎng)要素和發(fā)酵影響因素的一般規(guī)律，結合相關的文獻報道和筆者的前期實驗，本試驗選用實驗次數(shù)N=12的實驗設計，對接種量（X1）、培養(yǎng)溫度（X2）、葡萄糖用量（X3）、酵母膏（X4）、蛋白胨（X5）、KH2PO4（X6）、搖瓶轉(zhuǎn)速（X7）、搖瓶裝液量（X8）8個因素進行考察，分別對應于表中的8列，每個因素取兩個水平，響應值為樟芝菌體產(chǎn)量。運用Statistical Analysis System（SAS）8.0軟件分別計算各因素的菌體產(chǎn)量，并對各因素菌體產(chǎn)量進行t檢驗，選擇置信度較高的因素作為顯著因素作進一步考察。實驗設計及實驗結果見表3，各因素主效應分析結果見表4。

表3 Plackett-Burman實驗設計與結果Table 3 Plackett-Burman experimental design matrix and theexperimental results

由表3、4及表3中因素的P值可以看出接種量、培養(yǎng)溫度和葡萄糖用量這3個因素在α=0.05水平上對樟芝的菌體產(chǎn)量具有顯著影響，其P值分別為0.04305、0.04997和0.03768，其他因素在α=0.05的水平上對其表達量的影響不顯著。所以將接種量、培養(yǎng)溫度和葡萄糖用量這3個因素進一步采用響應面法進行優(yōu)化，以確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件，而其他因素的取值則根據(jù)各因素效應的正負和大小，正效應的因素均取較高值，負效應的因素均取較低值。

2.2 最陡爬坡實驗

響應面擬合方程只在考察的緊接鄰域里才充分近似真實情形，要先逼近最佳值區(qū)域后才能建立有效的響應面擬合方程。最陡爬坡法以實驗值變化的梯度方向為爬坡方向，根據(jù)各因素效應值的大小確定變化步長，能快速、經(jīng)濟地逼近最佳值區(qū)域[6]。由Plackett-Burman實驗結果設計主要因素的最陡爬坡路徑，其中接種量有顯著正效應，應增加；培養(yǎng)溫度和葡萄糖用量有顯著負效應，應減小。根據(jù)這3個因素效應大小的比例設定它們的變化方向及步長進行試驗，設計及結果如表5所示。

表4 各因素的主效應Table 4 Levels of the variables and effect in Plackett-Burmandesign

表5 最陡爬坡實驗設計及其試驗結果Table 5 Points on the first path of the steepest ascent study

由表5可見，最優(yōu)發(fā)酵條件可能在試驗3與試驗4之間，故以試驗3的條件為響應面實驗的中心點。

2.3 響應面分析實驗設計優(yōu)化樟芝發(fā)酵條件

依據(jù)Plackett-Burman實驗和最陡爬坡實驗確定的實驗因素與水平，采用Box-Benhnken實驗設計對樟芝發(fā)酵條件進行3因素3水平的響應面分析實驗，包括12個析因試驗和3個中心試驗。運用SAS軟件的RSREG(Response surface regression)程序?qū)?5個試驗點的響應值進行回歸分析。15個試驗點可分為兩類：其一是析因點，自變量取值在各因素所構成的三維頂點，共有12個析因點；其二是零點，為區(qū)域的中心點，零點試驗重復3次，用以估計試驗誤差，以樟芝菌體產(chǎn)量為響應值，經(jīng)回歸擬合后，確定函數(shù)表達式。試驗結果見表6。

表6 Box-Behnken試驗設計及相應結果Table 6 Box-Behnken design and the experimental results

該實驗回歸方程為：

采用SAS RSREG程序?qū)Ρ?數(shù)據(jù)進行ANOVA分析，結果見表7。

表7 回歸方程中回歸系數(shù)的估計值及方差分析Table 7 Results of the Box-Behnken design regression analysis

該方程回歸顯著，模型的復相關系數(shù)的平方即R2=99.27%，說明回歸方程的擬合程度良好，失擬較小，可以用該方程代替真實實驗點進行分析。由表6中的P值可知道，方程中X3對Y值的影響達顯著水平，而方程中 X1、X1X1、X2X2和 X3X3對 Y 值的影響達極顯著水平，表明實驗因子對響應值不是簡單的線性關系，二次項對響應值也有很大的關系，這和模型回歸中的線性和平方項影響顯著相對應。交互項系數(shù)均不顯著，所以交互作用的影響相對較小。失擬項的P=2.116，沒有顯著性影響，說明數(shù)據(jù)中沒有異常點，不需要引入更高次數(shù)的項，模型適當。

通過軟件分析，得出當樟芝菌體量最大時，X1=-0.0267；X2=0.0626；X3=-0.0732 ，計算得到樟芝液體發(fā)酵工藝最佳條件為：接種量15%、培養(yǎng)溫度26.1℃、葡萄糖添加量3.9%。此條件下，樟芝菌體產(chǎn)量最大值為7.03 g/L。為檢驗響應曲面法所得結果的可靠性，采用上述優(yōu)化發(fā)酵條件進行發(fā)酵培養(yǎng)，實際測得的樟芝菌體產(chǎn)量為7.06 g/L，與理論預測值相比，其相對誤差約為1%，因此，基于響應曲面法所得的樟芝發(fā)酵條件參數(shù)準確可靠，具有實用價值。

3 結論

實驗證明響應面方法是優(yōu)化發(fā)酵條件非常有效的工具，Plackett-Burman試驗設計能對影響樟芝發(fā)酵的各因素進行評價并能有效地找出主要因，最陡爬坡法能充分接近最大響應面區(qū)域，Box-Behnken實驗設計能建立主要因素影響樟芝菌體的二次多項數(shù)學模型，并利用統(tǒng)計學方法對該模型進行了顯著性檢驗，優(yōu)化了內(nèi)在因素水平，找出最佳值。本研究經(jīng)響應面方法優(yōu)化，得出樟芝真菌的最佳發(fā)酵條件為：接種量15%、培養(yǎng)溫度26.1℃、葡萄糖添加量3.9%，優(yōu)化條件下經(jīng)三批搖瓶培養(yǎng)實驗驗證，預測值與驗證試驗平均值接近，此培養(yǎng)條件下樟芝菌體產(chǎn)量可達到7.06 g/L。

[1]賈薇,劉艷芳,張勁松,等.樟芝深層發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化[J].食品科學，2004，25(5):52-55

[2]ILEE I H,LING R,CHEN C T.Antrodia camphorate polysac-harides exhibit anti-epatitis B virus effects[J].FEMS Micro-iol Lett,2002,209(1):63-67

[3]吳其威,黃瑞珊.樟芝菌發(fā)酵產(chǎn)物中多糖組分的分離與性質(zhì)研究[J].上海交通大學學報,1994,28(2):82-89

[4]Ahuja S K,Ferreira G M,Moreira A R.Application of Plackett-Burman design and response surface methodology to achieve exponential growth for aggregated shipworm bacterium[J].Biotechnology and bioengineering,2004,85(3):666-675

The Fermenting Condition of Culture Optimizing Study for Antrodia Camphorata Using of RSM

SUN Su-hua1,SUN Jin-xu1,ZHU Hui-xia1,GONG Jian-ying2,LIU Yan-li1
（1.Hengshui College,Hengshui 053000,Hebei,China;2.Hengshui High School,Hengshui 053000,Hebei,China）

2011-12-15

衡水學院資助課題（2008031）

孫素華（1970—），女（漢），副教授，碩士研究生，主要從事生物信息處理等方面的研究。