IL-2協(xié)同抗CD45RB抗體調(diào)節(jié)Treg/Th17細(xì)胞的比例并延長小鼠移植皮膚存活時(shí)間①

郭偉堅(jiān) 簡優(yōu)強(qiáng) 張國超 鄧春艷 齊 暉 李富榮 周漢新

(暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院深圳市人民醫(yī)院臨床研究中心，深圳518020)

抗CD45RB抗體是一種新型的免疫耐受誘導(dǎo)劑，可以通過上調(diào)CD45RBloT細(xì)胞和下調(diào)CD45RBhiT細(xì)胞的比例來延長移植物的存活時(shí)間，抑制排斥反應(yīng)的發(fā)生［1］。在小鼠腎、胰島和心臟移植應(yīng)用抗體治療都可以成功地延長移植物的存活時(shí)間并誘導(dǎo)產(chǎn)生穩(wěn)定的免疫耐受［2-4］。在免疫耐受誘導(dǎo)過程中，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulator T cell，Treg)與Th17細(xì)胞是一組作用相反的T細(xì)胞亞群，其中Treg細(xì)胞可以促進(jìn)免疫耐受的形成，而Th17細(xì)胞則會(huì)阻礙耐受的產(chǎn)生［5］。本課題組已證實(shí)了抗CD45RB抗體可以通過上調(diào)調(diào)節(jié)性CD4+CD25+CD127-T細(xì)胞百分率和增加Foxp3mRNA表達(dá)量來誘導(dǎo)小鼠心臟移植免疫耐受［6］，然而該抗體對Th17細(xì)胞的分化有何影響尚未清楚。在免疫耐受形成過程中，IL-2參與誘導(dǎo)初始CD4+CD25-T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為CD4+CD25+T細(xì)胞并表達(dá)Foxp3，使其具備調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞的特性［7］。此外，IL-2是Th17細(xì)胞分化的抑制因素，它通過STAT5信號(hào)傳導(dǎo)對Th17細(xì)胞的分化起到抑制作用［8］。本研究通過體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探討IL-2在抗CD45RB抗體誘導(dǎo)的免疫耐受中對Treg/Th17細(xì)胞的分化有何影響，并進(jìn)一步闡明抗CD45RB抗體誘導(dǎo)免疫耐受的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 雄性8周齡C57BL/6和BALB/c小鼠，體重20～25克，購自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(許可證號(hào):SCXK(粵)2006-0015)，飼養(yǎng)在SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室(暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)過當(dāng)?shù)貍惱砦瘑T會(huì)批準(zhǔn)，對動(dòng)物處置方法符合動(dòng)物倫理學(xué)要求。

1.1.2 試劑及器材 抗小鼠CD45RB抗體(美國BioXcell);小鼠IL-2(美國Peprotech公司);淋巴細(xì)胞分離液(達(dá)科為生物技術(shù)有限公司);抗小鼠CD4-PEcy5、IL-17A-FITC、Foxp3-PE 及相應(yīng)同型對照(eBioscience);佛波酯(Phorbol 12-Myristate 13 Acatate，PMA)、離子霉素及布雷菲德菌素A(Brefeldin-A，BFA)(美國Sigma公司);流式細(xì)胞儀(EPICS ALTRA，美國貝克曼庫爾特公司);小鼠CD4+T細(xì)胞陰性分選磁珠(德國美天旎)。

1.2 方法

1.2.1 初始CD4+T細(xì)胞的分選及鑒定 處死8周齡雄性C57BL/6小鼠，無菌取脾制成單細(xì)胞懸液，利用小鼠淋巴細(xì)胞分離液分離淋巴細(xì)胞。用免疫磁珠陰性分選其中的CD4+T細(xì)胞，每1×107個(gè)細(xì)胞用40 μl緩沖液(pH=7.2)重懸，每1×107個(gè)細(xì)胞先加入 10 μl Biotin-Antibody Cocktail混勻，4℃孵育10分鐘;然后加入 20 μl Anti-Biotin MicroBeads混勻，4℃孵育15分鐘，洗滌后用500 μl緩沖液重懸，并用分選柱通過磁珠分離器分選CD4+T細(xì)胞，分選出的CD4+T細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞免疫熒光染色，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞純度＞90%。

1.2.2 IL-2和抗CD45RB抗體與CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)對Treg/Th17分化的影響向24孔板中每孔加入CD4+T細(xì)胞 1×106個(gè)，將實(shí)驗(yàn)分為4個(gè)組:①CD4+T;②CD4+T+抗CD45RB抗體;③CD4+T+IL-2;④CD4+T+抗 CD45RB抗體 +IL-2，然后用10%FBS RPMI1640每孔定容至1 ml，其中加入抗CD45RB 抗體 為20 μg/ml、IL-2 為100 U/ml。37℃5%CO2培養(yǎng)72小時(shí)。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)72小時(shí)后取細(xì)胞作流式免疫熒光染色，流式細(xì)胞儀檢測Treg/Th17細(xì)胞百分率。

1.2.3 IL-2和抗CD45RB抗體對小鼠皮膚移植生存期的影響 取8周齡雄性BALB/c小鼠為供體，8周齡雄性C57BL/6小鼠為受體，進(jìn)行同種異基因小鼠皮膚移植。在供體鼠胸背部取1×1 cm的皮膚，去筋膜后移植至受體鼠胸背部，用5-0尼龍絲線縫合10～12針，術(shù)后用紅霉素眼膏+創(chuàng)口貼包扎，第7天打開包扎觀察皮膚存活情況。術(shù)后根據(jù)不同治療方案分為3個(gè)組，每組20只移植鼠。對照組:腹腔注射生理鹽水100 μl;抗CD45RB抗體組:在術(shù)后0、2、4、6、8 天給予腹腔注射抗 CD45RB 抗體100 μg/天;抗CD45RB抗體+IL-2組:在抗體CD45RB抗體治療同時(shí)，在術(shù)后0、1、2天給予腹腔注射IL-2 2 μg/天。術(shù)后小鼠蘇醒后單籠飼養(yǎng)，每日觀察活動(dòng)情況及皮膚移植物的存活狀況，記錄皮膚排斥壞死時(shí)間。

1.2.4 Th17/Treg細(xì)胞檢測 取上述共培養(yǎng)后72小時(shí)后的各組CD4+T細(xì)胞重懸;皮膚移植在術(shù)后第1、3、5、7、9 天，每組各處死 3 只小鼠取脾臟，制成脾細(xì)胞懸液。調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/ml，取100 μl細(xì)胞懸液分別加入 50 ng/ml PMA、1 μg/ml離子霉素、10 μg/ml BFA37℃ 刺激 6 小時(shí)。加入 1.5 μl CD4-PEcy5抗體，避光孵育15分鐘后，加入破膜/固定工作液對細(xì)胞固定和破膜，再加入抗IL-17A-FITC抗體和抗Foxp3-PE抗體各1.5 μl，染色30分鐘后清洗，流式細(xì)胞儀分析Treg和Th17細(xì)胞百分率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 統(tǒng)計(jì)處理采用SPSS13.0軟件，各組皮膚移植小鼠的皮膚移植物存活率及生存曲線用log-rank檢驗(yàn)。所有數(shù)據(jù)用x±s表示，兩組均數(shù)間的比較采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IL-2對抗CD45RB抗體誘導(dǎo)Treg/Th17細(xì)胞分化的影響 收集培養(yǎng)72小時(shí)后各組CD4+T細(xì)胞三色法染色后流式細(xì)胞儀檢測各組中CD4+FoxP3+Treg和 CD4+IL-17+Th17細(xì)胞的陽性率?？笴D45RB抗體作用于CD4+T細(xì)胞后可以促進(jìn)其向Treg細(xì)胞分化(11.53±0.57)%，抑制其向Th17細(xì)胞分化(3.13±0.32)%(圖1，P ＜0.05);在 IL-2共同作用下，增強(qiáng)向 Treg細(xì)胞分化作用(14.20±0.50)%，并抑制向Th17細(xì)胞分化作用(2.23±0.15)%(圖1，P ＜0.05)。

2.2 受體鼠皮膚移植存活期的觀察 移植術(shù)后小鼠在不給予抗體治療的對照組小鼠皮膚移植物只能存活10天左右;使用抗CD45RB抗體治療可以延長存活期至20天;抗CD45RB抗體與IL-2聯(lián)合治療，可顯著延長存活期至25天(圖2)。

2.3 受體鼠移植皮膚的病理學(xué)變化 在移植后第9天，取各組皮膚移植物作病理切片，觀察移植皮膚的炎性細(xì)胞浸潤情況，正常小鼠皮膚無炎性細(xì)胞浸潤(圖3A);對照組移植皮膚具有嚴(yán)重的細(xì)胞，炎癥細(xì)胞浸潤皮膚全層(圖3B);抗CD45RB抗體組有輕度的炎性細(xì)胞浸潤(圖3C);抗CD45RB抗體+IL-2組只有少量炎性細(xì)胞浸潤(圖3D)。各治療組小鼠移植皮膚雖然有炎癥細(xì)胞浸潤，但僅限于筋膜層，真皮層浸潤并不嚴(yán)重。

2.4 受體鼠體內(nèi)Treg和Th17細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化對皮膚移植小鼠，在術(shù)后第1、3、5、7、9天取脾細(xì)胞，觀察Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化。對Treg細(xì)胞觀察，在對照組中沒有明顯變化，抗CD45RB抗體組隨時(shí)間明顯上升，抗CD45RB抗體+IL-2組上升最快最明顯，較對照組和抗CD45RB抗體組明顯升高(圖4)。在Th17細(xì)胞觀察中，對照組升高最快最明顯，抗CD45RB抗體組呈中度升高，抗CD45RB抗體+IL-2組只有輕度升高(圖5)。

圖1 體外各組CD4+T細(xì)胞培養(yǎng)72小時(shí)后Treg/Th17細(xì)胞所占的比例Fig．1 The percentage of Treg/Th17 cells in cultured CD4+T cells detected by FCM in vitro

圖2 移植皮膚生存曲線Fig．2 Survival curves of skin graft

圖3 各組皮膚移植小鼠術(shù)后第9天移植皮膚的病理切片F(xiàn)ig．3 Histology of BALB/c mouse skin allografts on day 9 after transplantation

圖4 體內(nèi)Treg細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化Fig．4 Dynamic changes of Treg cells in vivo

圖5 體內(nèi)Treg細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化Fig．5 Dynamic changes of Th17 cells in vivo

3 討論

大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，抗CD45RB抗體可以成功誘導(dǎo)免疫耐受并能逆轉(zhuǎn)排斥反應(yīng)?？笴D45RB抗體誘導(dǎo)免疫耐受可通過多種途徑發(fā)揮作用，它可以通過上調(diào)CTLA-4分子向T細(xì)胞釋放負(fù)向調(diào)節(jié)信號(hào)［9-11］;在誘導(dǎo)免疫耐受過程中需要完整的胸腺，并通過胸腺產(chǎn)生供體特異性Treg細(xì)胞誘導(dǎo)免疫耐受，在缺失胸腺的情況下雖然在外周免疫系統(tǒng)中依然有免疫抑制的活性，但并不能夠誘導(dǎo)免疫耐受的形成［12］;在誘導(dǎo)免疫耐受時(shí)需要宿主B淋巴細(xì)胞的參與，并且通過B細(xì)胞與T細(xì)胞的相互作用誘導(dǎo)免疫耐受［13］;通過有效抑制成熟樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells，DCs)的功能和產(chǎn)生耐受型DCs誘導(dǎo)免疫耐受的形成［14］。此外，抗體還可以清除引起免疫排斥反應(yīng)的CD45RBhiT細(xì)胞，使CD45RBloT細(xì)胞富集，從而調(diào)節(jié)CD45RBloT細(xì)胞與CD45RBhiT細(xì)胞的比例，抑制排斥反應(yīng)的發(fā)生，延長移植物的存活時(shí)間甚至誘導(dǎo)產(chǎn)生穩(wěn)定的特異性免疫耐受［15］。

在免疫耐受形成過程中，Treg細(xì)胞發(fā)揮著舉足輕重的作用，多種誘導(dǎo)免疫耐受方案是通過各種免疫耐受誘導(dǎo)劑促使T細(xì)胞向FoxP3+Treg細(xì)胞分化從而產(chǎn)生穩(wěn)定的免疫耐受［16］。外周免疫系統(tǒng)中的初始CD4+T細(xì)胞在TGF-β和IL-2的共同作用下可以向Treg分化，并通過分泌TGF-β和IL-10發(fā)揮著免疫調(diào)節(jié)的作用來誘導(dǎo)免疫耐受［17］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，免疫系統(tǒng)中存在著一種功能與Treg細(xì)胞相反的Th細(xì)胞亞群，這種Th細(xì)胞以分泌IL-17為特征，稱為Th17細(xì)胞，參與自身免疫性疾病及免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生。活化后的初始CD4+T細(xì)胞在TGF-β和IL-6的共同作用下可以向Th17分化，并通過分泌IL-17來介導(dǎo)炎性反應(yīng)，抑制免疫耐受的產(chǎn)生［5］。Treg與Th17細(xì)胞作為一組作用相反的T細(xì)胞亞群，它們共同由初始CD4+T細(xì)胞分化而來，Treg/Th17細(xì)胞在體內(nèi)誰占上峰發(fā)揮主導(dǎo)作用，決定免疫耐受或免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生程度［5］。在本研究中，抗CD45RB抗體與CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)，抗CD45RB抗體具有促進(jìn)CD4+T細(xì)胞向Treg細(xì)胞分化，抑制向Th17細(xì)胞分化作用。在同種異體皮膚移植模型中，抗CD45RB抗體的治療，使移植物存活期明顯延長，同時(shí)Treg細(xì)胞數(shù)量較對照組逐漸明顯升高，Th17細(xì)胞數(shù)量呈下降。上調(diào)Treg細(xì)胞和抑制Th17細(xì)胞數(shù)量可能是抗CD45RB抗體誘導(dǎo)免疫耐受的主要機(jī)制之一。

IL-2是一種T細(xì)胞生長因子，主要由活化狀態(tài)下的效應(yīng)T細(xì)胞分泌，在Treg的分化、發(fā)育過程中發(fā)揮著很重要的作用，它通過與IL-2R結(jié)合進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)，從而增加未成熟Treg表達(dá)Foxp3和CD25，并促進(jìn)其向成熟 Treg分化［18］。此外，IL-2還可以通過STAT5信號(hào)傳導(dǎo)途徑，下調(diào)多種Th17細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá)，抑制Th17細(xì)胞分化。在我們的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，IL-2與抗CD45RB抗體共同作用下，可增強(qiáng)抗CD45RB抗體促進(jìn)CD4+T細(xì)胞向Treg細(xì)胞分化作用，也增強(qiáng)抗CD45RB抗體抑制其向Th17細(xì)胞分化作用。在同種異體皮膚移植小鼠中，用IL-2聯(lián)合抗CD45RB抗體治療，較抗CD45RB抗體單獨(dú)治療，生存期明顯延長，移植皮膚中炎癥細(xì)胞的浸潤明顯減少。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，抗CD45RB抗體并不能直接作用于Treg細(xì)胞使其擴(kuò)增，但它可以使低表達(dá)CD45RB分子的Treg細(xì)胞富集。由于IL-2具有促進(jìn)Treg細(xì)胞分化并抑制Th17細(xì)胞分化的作用，與抗 CD45RB抗體聯(lián)合應(yīng)用后可增強(qiáng)抗CD45RB抗體對Treg/Th17細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用，提示IL-2具有協(xié)同抗CD45RB抗體的作用，延緩排斥反應(yīng)的發(fā)生，延長移植皮膚的存活時(shí)間。

綜上所述，抗CD45RB抗體在誘導(dǎo)免疫耐受中，具有上調(diào)Treg細(xì)胞和抑制Th17細(xì)胞的作用，IL-2可以增強(qiáng)抗CD45RB抗體的作用，延緩小鼠同種異基因皮膚移植排斥反應(yīng)的發(fā)生，延長移植物的存活時(shí)間。因此，在抗CD45RB抗體誘導(dǎo)免疫耐受時(shí)聯(lián)合應(yīng)用IL-2治療可以更有效地誘導(dǎo)免疫耐受，為免疫耐受的誘導(dǎo)提供新的治療策略。

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