DAPK1、ERα、HLA-Ⅰ基因蛋白表達(dá)水平與宮頸病變病理進(jìn)程的相關(guān)性

古麗夏西·莫合衣提江 阿比達(dá)·阿布都卡德?tīng)?阿布力孜·阿布杜拉 丁 巖

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科，新疆 烏魯木齊 830054)

宮頸癌主要致病原因包括高危型人乳頭狀瘤病毒(HPV)感染，但多數(shù)HPV感染者并未發(fā)展為宮頸癌，這說(shuō)明尚有其他分子事件或遺傳事件參與其發(fā)生。從分子生物學(xué)角度說(shuō)，宮頸癌發(fā)生發(fā)展是個(gè)多基因參與的過(guò)程，從不同角度聯(lián)合檢測(cè)觀察多個(gè)腫瘤相關(guān)基因變化及其引起的生物學(xué)特征改變，對(duì)于闡明和補(bǔ)充其發(fā)病機(jī)制及找到能反映宮頸病變嚴(yán)重程度的生物指標(biāo)具有重大意義。本文從蛋白質(zhì)水平觀察死亡相關(guān)蛋白激酶(DAPK1)、人類(lèi)白細(xì)胞抗原-Ⅰ(HLA-Ⅰ)、雌激素受體(ER)α基因與宮頸病變病理進(jìn)程的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 2006～2008年我院病理科存檔的中老年漢族婦女子宮頸活檢及手術(shù)切除的宮頸癌及宮頸病變患者石蠟標(biāo)本115例，包括宮頸炎/CINⅠ41例，CINⅡ/Ⅲ49例，宮頸癌25例，標(biāo)本由10%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，標(biāo)本采集前均未經(jīng)任何放療、化療、免疫治療，年齡24～60(平均42)歲。均經(jīng)本院病理科有經(jīng)驗(yàn)的副主任醫(yī)師反復(fù)閱片后重新明確診斷。

1.2 主要試劑及儀器 主要試劑及儀器有 DAPK1、ERα、HLA-Ⅰ等特異性抗體(購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司);免疫組織化學(xué)SP方法試劑、酶標(biāo)二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)公司)，另有光學(xué)顯微鏡(BA210，Motic)。

1.3 免疫組織化學(xué)方法 采用免疫組織化學(xué)SP法。首先取石蠟包埋組織，制作成厚度為4 μm組織切片，然后脫蠟、水化和加熱法(微波)抗原修復(fù)。再以H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，滴加稀釋過(guò)的相應(yīng)的DAPK1、ERα、HLA-Ⅰ等特異性抗體(一抗)，4℃過(guò)夜。第二天，滴加1∶2稀釋的SP標(biāo)記二抗(山羊抗兔，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記)，在37℃孵育1 h后依次加入DAB和蘇木精顯色，并常規(guī)脫水和透明封片。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.4 免疫組織化學(xué)結(jié)果判定 細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒判定為陽(yáng)性。細(xì)胞染色百分率以以下標(biāo)準(zhǔn)判定:在顯微鏡下觀察，記錄各切片染色細(xì)胞百分比，染色細(xì)胞數(shù)＜5%為0分，5%≤染色細(xì)胞數(shù)≤25%1分，26%≤染色細(xì)胞數(shù)≤75%2分，染色細(xì)胞數(shù)＞75%3分。染色強(qiáng)度判定標(biāo)準(zhǔn):不顯色或顯色不清0分，淺黃色1分，棕黃色2分，深棕色3分。綜合積分按公式計(jì)算:綜合積分=(染色細(xì)胞分?jǐn)?shù)+染色強(qiáng)度分?jǐn)?shù))/2;綜合判定:積分 ＜0.5分為“－”(缺失)，0.5分≤積分≤1.5分為“+”(不完全表達(dá))，積分＞1.6分為“”(完全表達(dá))。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 DAPK-1蛋白表達(dá)與宮頸病變病理進(jìn)程的關(guān)系 DAPK-1蛋白陽(yáng)性表達(dá)主要分布在上皮細(xì)胞質(zhì)，著色呈淺黃到棕黃色，DAPK-1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率在CINⅡ/Ⅲ和宮頸癌中明顯降低，且DAPK1陽(yáng)性表達(dá)率在宮頸癌組和CINⅡ/Ⅲ組中明顯低于宮頸炎/CINⅠ組(P均＜0.05)，宮頸癌組DAPK-1陽(yáng)性表達(dá)率低于CINⅡ/Ⅲ組，但差異不顯著(P均＞0.05)。見(jiàn)表1，圖1。

2.2 ERα蛋白表達(dá)與宮頸病變病理進(jìn)程的關(guān)系 不同宮頸病變組織免疫組化染色結(jié)果顯示ERα蛋白表達(dá)主要分布在細(xì)胞核、宮頸上皮細(xì)胞、幾乎所有的宮頸間質(zhì)細(xì)胞、炎細(xì)胞中。宮頸炎/CINⅠ組與CINⅡ/Ⅲ組和宮頸癌組比較兩者之間差異顯著(P均＜0.05)，但CINⅡ/Ⅲ組與宮頸鱗癌中陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異不顯著(P＞0.05)。見(jiàn)表2，圖2。

表1 不同宮頸病變中DAPK1表達(dá)情況〔n(%)〕

圖1 DAPK1蛋白在不同宮頸病變組織中的表達(dá)(×400)

2.3 HLA-Ⅰ蛋白表達(dá)與宮頸癌及癌前病變相關(guān)性 HLA-Ⅰ蛋白陽(yáng)性表達(dá)主要定位于上皮細(xì)胞膜上，細(xì)胞膜著色呈淺黃到棕褐色。CINⅡ/Ⅲ上皮內(nèi)HLA-Ⅰ表達(dá)明顯降低，宮頸癌內(nèi)表達(dá)最低，不同病理級(jí)別宮頸病變中HLA-Ⅰ蛋白質(zhì)表達(dá)水平差異顯著(P均＜0.05)，在宮頸病變中HLA-Ⅰ基因蛋白質(zhì)表達(dá)隨著宮頸病變病理變化加重而遞減。見(jiàn)表3，圖3。

表2 不同宮頸病變中ERα的表達(dá)情況〔n(%)〕

圖2 ERα蛋白在不同宮頸病變組織中的表達(dá)(×400)

表3 不同宮頸病變中HLA-Ⅰ表達(dá)情況〔n(%)〕

圖3 HLA-1蛋白在不同宮頸病變組織內(nèi)的表達(dá)(×400)

3 討論

高危型HPV感染被認(rèn)為是宮頸癌發(fā)生發(fā)展中必需的主要致病原因，但宮頸癌的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。宮頸癌發(fā)生發(fā)展是多基因、多因素共同作用的復(fù)雜過(guò)程。癌基因的激活、抑癌基因的失活是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的最重要分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

DAPK是一種160 kU的鈣調(diào)蛋白(CaM)調(diào)節(jié)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是凋亡的正性調(diào)節(jié)因子，而凋亡與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)〔1〕。DAPK1是已確認(rèn)的抑癌基因，以往研究表明DAPK1基因在多種腫瘤細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞系中失活，主要機(jī)制是由于異常的DNA甲基化修飾，從而使抑癌基因表達(dá)沉默，促使細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化〔2，3〕。Yang 等〔4〕對(duì) 85 例宮頸癌手術(shù)樣本及40例預(yù)處理的血漿樣本采用甲基化特異聚合酶鏈反應(yīng)(MSP)對(duì)于DAPK基因行甲基化分析檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)60%手術(shù)樣本和40%血漿樣本發(fā)生DAPK甲基化，異常甲基化宮頸癌組織及血漿中DAPK表達(dá)明顯減少甚至缺失。本研究結(jié)果提示DAPK1缺失可能是CIN和宮頸癌發(fā)生發(fā)展的重要分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

宮頸癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中免疫監(jiān)視系統(tǒng)可能起重要作用。HLA系統(tǒng)是免疫系統(tǒng)中重要組成部分，腫瘤分子免疫學(xué)已證實(shí)了HLA-Ⅰ類(lèi)分子在腫瘤免疫中處于重要的地位。1977年人類(lèi)腫瘤細(xì)胞HLA分子缺失首次被發(fā)現(xiàn)，到目前為止人們已發(fā)現(xiàn)多種腫瘤細(xì)胞存在HLA分子缺失。研究證實(shí)HLA-Ⅰ類(lèi)抗原在宮頸癌中常表達(dá)缺失，且部分HLA-Ⅰ類(lèi)抗原表達(dá)缺失與5年生存率有顯著關(guān)聯(lián)〔5〕。本研究結(jié)果提示，可能由于HLA-Ⅰ蛋白在CINⅢ病變中表達(dá)明顯減少，從而腫瘤得以發(fā)生、發(fā)展。HLA-1蛋白減少使得細(xì)胞毒性T細(xì)胞無(wú)法發(fā)揮其特異性殺傷靶細(xì)胞的作用，出現(xiàn)了免疫逃逸現(xiàn)象即HPV感染后所致的異型細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞避開(kāi)了免疫系統(tǒng)的監(jiān)視作用導(dǎo)致了腫瘤發(fā)生發(fā)展。由此可見(jiàn)，HLA-Ⅰ抗原對(duì)于阻止CIN及宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展及改善可能起重要作用。

ER是類(lèi)固醇受體超家族中的一員，位于細(xì)胞核內(nèi)，是雌激素調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子，分為ERα和ERβ兩種亞型。ER在婦科腫瘤發(fā)生中可能起重要作用。ER及其功能途徑受到多重調(diào)控，其通過(guò)自身磷酸化，或與不同生長(zhǎng)因子、共調(diào)節(jié)因子、癌基因或抑癌基因蛋白結(jié)合或相互作用，從而調(diào)節(jié)靶細(xì)胞生長(zhǎng)分化。Nonogaki等〔6〕發(fā)現(xiàn)ERα在宮頸正常組織中表達(dá)率較非典型增生及宮頸癌組織中高。研究報(bào)道〔7〕，無(wú)論是正常宮頸組織，還是CIN鱗狀上皮和浸潤(rùn)性宮頸鱗癌組織ER表達(dá)情況不同，HPV感染型別亦不同。在ERα陰性宮頸組織中，HPV16、18型感染更多見(jiàn);而ERα陽(yáng)性宮頸組織，多為HPV31、33、35型等感染。這些研究結(jié)果說(shuō)明ERα表達(dá)缺失可能是HPVl6/18致宮頸癌機(jī)制中不可缺少的環(huán)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)ERα過(guò)度甲基化與宮頸癌發(fā)病的關(guān)系，并認(rèn)為ERα可能是抑癌基因，且與其他甲基化敏感基因聯(lián)合檢測(cè)，可大大提高腫瘤檢出率〔8〕。ERα異常甲基化必然導(dǎo)致其轉(zhuǎn)錄水平變化，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)表達(dá)降低或缺陷，但闡述宮頸病理進(jìn)程與ERα基因表達(dá)水平變化關(guān)系文獻(xiàn)并不多。本研究結(jié)果與以往文獻(xiàn)報(bào)道一致〔9〕。ERα核表達(dá)下調(diào)或缺失可能是宮頸鱗癌發(fā)生的重要機(jī)制。ERα蛋白在宮頸病變組織中的表達(dá)水平在一定程度上對(duì)預(yù)測(cè)宮頸病變嚴(yán)重程度有幫助。

總之，DAPK1、HLA-Ⅰ、ERα等基因蛋白表達(dá)水平均隨著宮頸病變病理變化的加重而降低，這些基因表達(dá)缺失可能是CIN及宮頸鱗癌的重要生物學(xué)特征，有望作為預(yù)測(cè)宮頸癌前病變及宮頸癌的早期預(yù)警指標(biāo)，另外DAPK1、HLA-Ⅰ、ERα等基因蛋白表達(dá)也有可能成為宮頸癌基因治療中有效的新的靶基因，本研究為宮頸癌前病變及宮頸癌基因甲基化等機(jī)制研究提供了重要基礎(chǔ)和候選基因。

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