北蟲(chóng)草發(fā)酵過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)成分及代謝物變化研究

解春艷，凌 威，顧穎娟，顧振新，*

（1.廊坊師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，河北廊坊 065000；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部農(nóng)畜產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210095）

北蟲(chóng)草發(fā)酵過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)成分及代謝物變化研究

解春艷1，凌 威1，顧穎娟2，顧振新2，*

（1.廊坊師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，河北廊坊 065000；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部農(nóng)畜產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210095）

研究了北蟲(chóng)草搖瓶發(fā)酵過(guò)程中培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分及其代謝物質(zhì)變化情況，測(cè)定了培養(yǎng)基的pH、總糖、還原糖和可溶性蛋白及游離氨基酸等成分含量，探明了北蟲(chóng)草菌體生長(zhǎng)、多糖及蟲(chóng)草素生成規(guī)律。結(jié)果顯示：隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵液的pH、可溶性固形物、總糖和還原糖含量均總體呈下降趨勢(shì)；游離氨基酸含量呈先變化遲緩而后上升趨勢(shì)；北蟲(chóng)草菌絲體及蟲(chóng)草素產(chǎn)量隨時(shí)間延長(zhǎng)先增加后下降；粗多糖含量總體略呈下降趨勢(shì)。

北蟲(chóng)草，菌絲體，粗多糖，蟲(chóng)草素，液態(tài)深層發(fā)酵

Abstract：The change of the main nutriments of the medium and the metabolites during shake flash fermentation of Cordyceps militaris was investigated.The pH，total sugar，deoxidized sugar，free amino nitrogen and soluble protein was detected，and the growth of Cordyceps militaris and the production of crude polysaccharide and cordycepin were also determined.Results indicated that soluble solid components，total sugar and deoxidized sugar was reduced with prolong of the fermentation，and mycelium and cordycepin was increased firstly and then reduced.The content of free amino nitrogen was firstly changed slowly and then increased.The crude polysaccharide was reduced a few.

Key words：Cordyceps militaris；mycelium；crude polysaccharide；cordycepin；submerged fermentation

北蟲(chóng)草（Cordyceps militaris）又名北冬蟲(chóng)夏草、蛹蟲(chóng)草等，是我國(guó)名貴的藥用真菌和新資源食品。其中富含蟲(chóng)草多糖、蟲(chóng)草素等特征功能成分[1-2]，因而具有提高人體免疫力、緩解疲勞、抗腫瘤、抗衰老、降血脂等功能[3-6]。研究表明，人工培養(yǎng)的北蟲(chóng)草菌絲體與天然蟲(chóng)草具有相同的功效[7-8]，可作為天然蟲(chóng)草的替代品。國(guó)內(nèi)外學(xué)者也采用多種方法獲得北蟲(chóng)草菌絲體[1，9]，液態(tài)深層發(fā)酵因其發(fā)酵周期短、發(fā)酵條件易控制，是目前報(bào)道較多的一種發(fā)酵方法。發(fā)芽糙米、豆粕和大麥芽中富含有充足的碳源、氮源和微量元素，已證實(shí)北蟲(chóng)草可在上述原料組成的培養(yǎng)基中良好生長(zhǎng)[10]。本文采用前期優(yōu)化得到的上述幾種原料混合而成的物質(zhì)為發(fā)酵培養(yǎng)基，在確定的最佳發(fā)酵條件下培養(yǎng)，以期對(duì)發(fā)酵過(guò)程中培養(yǎng)液的主要營(yíng)養(yǎng)成分、pH和北蟲(chóng)草特征代謝產(chǎn)物進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

北蟲(chóng)草 CM-3菌株，購(gòu)自江蘇省農(nóng)科院食用菌研究所；發(fā)芽糙米、大麥芽和豆粕 購(gòu)自南京市集貿(mào)市場(chǎng)；淀粉酶、糖化酶及木瓜蛋白酶 均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；3，5-二硝基水楊酸、考馬斯亮藍(lán)G-250、茚三酮、亮氨酸、牛血清白蛋白（BSA）、無(wú)水乙醇等 均購(gòu)自南京化學(xué)試劑有限公司；斜面及平板培養(yǎng)基 采用PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯20%，葡萄糖2%，瓊脂2%，pH自然）；種子培養(yǎng)基 采用PD液體培養(yǎng)基，裝液量60mL/250mL，pH自然；發(fā)酵培養(yǎng)基 裝液量60mL/250mL，以發(fā)芽糙米漿、麥芽汁和豆粕汁為原料，按三者比例為55∶5∶40進(jìn)行配制，調(diào)pH為6.0。

FSD-100A型電動(dòng)粉碎機(jī) 臺(tái)州市新恩精密糧儀有限公司；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國(guó)華電器有限公司；DJM-50L膠體磨 上海東華高壓均質(zhì)機(jī)廠；手持折光儀（Brix0～32%） 日本產(chǎn)；UV-2802紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 尤尼柯（上海）儀器有限公司；DZ-900往復(fù)式搖床 江蘇太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；LDZX-40AI立式自動(dòng)壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；DHG-9030A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)芽糙米漿、麥芽汁和豆芽汁、豆粕汁及豆汁的制備 發(fā)芽糙米漿：發(fā)芽糙米經(jīng)粉碎后過(guò)60目篩，取一定量發(fā)芽糙米粉，添加4倍體積蒸餾水，混勻，于90～95℃糊化30min；降溫至60℃，添加0.2%發(fā)芽糙米粉質(zhì)量的α-淀粉酶，60℃保持1h。液化后，將混合物過(guò)膠體磨，添加0.2%發(fā)芽糙米粉質(zhì)量的糖化酶，混勻后于60℃保溫2h；之后過(guò)150目篩，調(diào)節(jié)其可溶性固形物含量為6°Brix。

麥芽汁：大麥芽經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后過(guò)60目篩，取一定量麥芽粉添加4倍體積蒸餾水，混勻后于35～37℃保溫30min，50～55℃保溫60min，65℃保溫3h。水解后，將混合物離心，轉(zhuǎn)速為4000r/min，時(shí)間10min；混合上清液并調(diào)節(jié)其可溶性固形物為6°Brix。

豆粕汁：豆粕經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后過(guò)60目篩，取一定量豆粕粉添加10倍體積蒸餾水，100℃保持10～15min；降溫至60℃，添加0.2%豆粕質(zhì)量的木瓜蛋白酶，混勻，于60℃保持2h；后將混合物離心，轉(zhuǎn)速為4000r/min，時(shí)間10min；收集上清液并調(diào)節(jié)其可溶性固形物為6°Brix。

1.2.2 種子液的制備 斜面試管菌種點(diǎn)種于PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中央，25℃培養(yǎng)6d后，用直徑為6mm的打孔器取4片菌種，接種于種子培養(yǎng)基中，25℃搖床（100r/min）培養(yǎng)5d。

1.2.3 液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng) 種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)液中，接種量為10%，溫度25℃，搖床轉(zhuǎn)速為100r/min，培養(yǎng)時(shí)間7d。

1.2.4 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.2.4.1 菌體干重 北蟲(chóng)草發(fā)酵液過(guò)150目不銹鋼篩網(wǎng)，用蒸餾水沖洗菌絲體至洗出液無(wú)色，收集菌絲于60℃烘至恒重。

1.2.4.2 菌體中蟲(chóng)草素含量 取0.5g已烘干菌體，以1∶10料液比添加50%乙醇，于50℃超聲波中超聲提取60min后，離心，將上清液用50%的乙醇溶液定容至10mL，取1mL用0.45μm濾膜過(guò)濾，濾液用安捷倫1200液相色譜測(cè)定，色譜柱為Prodigy ODS-C18反相色譜柱，4.6mm×250mm，5μm，進(jìn)樣量20μL，流動(dòng)相為甲醇和0.02mol/L的磷酸二氫鉀，體積比為15∶85，流速1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為260nm，測(cè)定溫度為40℃[11-12]。

1.2.4.3 胞外粗多糖 取離心所得上清液10mL，加入4倍體積的無(wú)水乙醇，于4℃冰箱中靜置12h，4000r/min離心20min，沉淀，于65℃烘至恒重，每處理重復(fù)3次[13]。

1.2.4.4 其他指標(biāo) 對(duì)離心得到上清液的總糖、還原糖、可溶性固形物、pH、游離氨基酸和可溶性蛋白等指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 北蟲(chóng)草菌絲體生長(zhǎng)曲線

如圖1所示，北蟲(chóng)草接種后，能較快地適應(yīng)新的環(huán)境，其菌絲體迅速生長(zhǎng)，延遲期表現(xiàn)不明顯；在其生長(zhǎng)1～5d時(shí)，是北蟲(chóng)草菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在該過(guò)程中，北蟲(chóng)草菌呈直線生長(zhǎng)；當(dāng)生長(zhǎng)至第5d時(shí)，由于其繁殖產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物對(duì)其生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用，使得北蟲(chóng)草菌絲體產(chǎn)量不再增加，進(jìn)入菌體生長(zhǎng)穩(wěn)定期；發(fā)酵至第8d時(shí)，菌絲體產(chǎn)量下降，北蟲(chóng)草的生長(zhǎng)進(jìn)入衰亡狀態(tài)。

圖1 北蟲(chóng)草菌絲體干重的變化Fig.1 Change of dry mycelium weight of Cordyceps militaris with fermentation

2.2 北蟲(chóng)草胞外粗多糖產(chǎn)量的變化

由圖2可知，在北蟲(chóng)草發(fā)酵過(guò)程中，胞外粗多糖含量總體略呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。在發(fā)酵初期，菌絲體生長(zhǎng)較少，胞外多糖分泌較少，而本研究中以發(fā)芽糙米、大麥芽和豆粕為培養(yǎng)基，其中富含有非蟲(chóng)草多糖的粗多糖，因而在初期粗多糖含量較高；而后隨著菌絲體的生長(zhǎng)，其生成多糖含量略有增加，而其生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的淀粉酶、纖維素酶等具有降解原料中粗多糖的能力[13]，使多糖含量下降，而在圖2中顯示的是兩者差值，故多糖含量略有下降。第7d始，菌絲體進(jìn)入其衰亡期，對(duì)原料消耗量顯著下降，而使胞外粗多糖略有增加。

圖2 北蟲(chóng)草培養(yǎng)液中胞外粗多糖含量的變化Fig.2 Change of extracellular polysaccharide content in the medium of Cordyceps militaris

2.2 北蟲(chóng)草菌絲體胞內(nèi)蟲(chóng)草素含量變化

在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，北蟲(chóng)草菌體中蟲(chóng)草素含量呈先增加后下降的變化趨勢(shì)（圖3），且在不同的生長(zhǎng)階段其增加趨勢(shì)略有不同。在發(fā)酵初期（0～2d），菌體生長(zhǎng)緩慢，其代謝產(chǎn)物蟲(chóng)草素也呈緩慢的增長(zhǎng)；在北蟲(chóng)草生長(zhǎng)3～5d中，處于其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，該過(guò)程中菌體中的蟲(chóng)草素含量也顯著增加；而后進(jìn)入穩(wěn)定期，該過(guò)程中，蟲(chóng)草素生成繼續(xù)增加，在第7d時(shí)，北蟲(chóng)草菌體中蟲(chóng)草素含量最高，為1.73mg/g；在第7d后，發(fā)酵進(jìn)入北蟲(chóng)草的衰亡期，部分菌體出現(xiàn)自溶，菌體內(nèi)的物質(zhì)釋放到胞外，進(jìn)而測(cè)得菌絲體中蟲(chóng)草素含量呈下降趨勢(shì)。

圖3 北蟲(chóng)草菌絲體中蟲(chóng)草素糖含量的變化Fig.3 Change of intracellular cordycepin content of Cordyceps militaris

2.4 北蟲(chóng)草發(fā)酵液中pH的變化

由圖4可知，在北蟲(chóng)草液態(tài)深層發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵液的pH在發(fā)酵開(kāi)始后的3d內(nèi)變化顯著，由pH5.3降至pH4.5，這主要是由于北蟲(chóng)草菌絲體的耗氧生長(zhǎng)繁殖，發(fā)酵前3d由于菌體的大量生長(zhǎng)繁殖，在這個(gè)過(guò)程中通過(guò)EMP和TCA途徑產(chǎn)生有機(jī)酸等酸性物質(zhì)[14]，導(dǎo)致pH急劇下降。發(fā)酵3d后pH緩慢下降并最終穩(wěn)定在4.5左右，說(shuō)明北蟲(chóng)草在生長(zhǎng)階段有自我調(diào)節(jié)酸堿度的能力。

圖4 北蟲(chóng)草培養(yǎng)液pH的變化Fig.4 Change of pH in the medium of Cordyceps militaris

2.5 北蟲(chóng)草發(fā)酵液可溶性固形物含量的變化

北蟲(chóng)草發(fā)酵液的可溶性固形物含量先下降后基本不變而后又略有增加（如圖5所示）。在發(fā)酵0～4d時(shí)，發(fā)酵液可溶性固形物含量顯著下降，而后在5～7d，可溶性固形物含量基本不變，在8d，該指標(biāo)又略有增加；發(fā)酵液中可溶性固形物含量的變化與菌絲體的生長(zhǎng)具有相關(guān)性，發(fā)酵初期，菌絲體迅速生長(zhǎng)，大量消耗培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分，使得發(fā)酵液的可溶性固形物含量顯著下降，而后菌體生長(zhǎng)緩慢，消耗減少，可溶性固形物含量變化不大，最后部分菌體自溶，釋放其內(nèi)容物，進(jìn)而使發(fā)酵液可溶性固形物略有上升。

圖5 北蟲(chóng)草培養(yǎng)液的可溶性固形物含量的變化Fig.5 Change of soluble solids in the medium of Cordyceps militaris

2.6 北蟲(chóng)草發(fā)酵液中總糖和還原糖含量變化

如圖6所示，隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，北蟲(chóng)草培養(yǎng)液中總糖和還原糖含量的變化趨勢(shì)基本相同，兩者間的相關(guān)系數(shù)可達(dá)0.993；在發(fā)酵0～5d，發(fā)酵液中總糖和還原糖含量顯著下降，而后兩者含量變化不明顯。其原因是發(fā)酵初期，北蟲(chóng)草菌絲體大量繁殖，迅速消耗培養(yǎng)基中的碳源，進(jìn)而使總糖和還原糖含量顯著下降；在發(fā)酵5～7d時(shí)，菌絲體處于其穩(wěn)定期，不再生長(zhǎng)，對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分消耗下降，而表現(xiàn)出總糖和還原糖含量基本不變。

圖6 北蟲(chóng)草培養(yǎng)液中總糖和還原糖含量的變化Fig.6 Change of total sugar and reducing sugar content in the medium of Cordyceps militaris

2.7 北蟲(chóng)草發(fā)酵液中可溶性蛋白和游離氨基酸含量變化

由圖7可見(jiàn)，可溶性蛋白與游離氨基酸含量變化趨勢(shì)顯著不同，隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，游離氨基酸先變化遲緩后上升，而可溶性蛋白含量先下降后上升；在發(fā)酵初期，菌絲體大量生長(zhǎng)，進(jìn)而需要消耗氮源，使得可溶性蛋白含量顯著下降；而后隨著蛋白酶的分泌，將水解培養(yǎng)基中不溶性蛋白將其轉(zhuǎn)化為可溶性蛋白或游離氨基酸，進(jìn)而測(cè)定結(jié)果為可溶性蛋白和游離氨基酸在發(fā)酵4～8d時(shí)呈增加趨勢(shì)。報(bào)道稱(chēng)，北蟲(chóng)草生長(zhǎng)中對(duì)氮源要求較高，其適宜在氨基酸等簡(jiǎn)單氮源中生長(zhǎng)[15]，即在培養(yǎng)基中優(yōu)先消耗氨基酸；在生長(zhǎng)后期時(shí)，培養(yǎng)基中氨基酸含量下降，北蟲(chóng)草大量生成蛋白酶以水解蛋白，為其生長(zhǎng)提供游離氨基酸[16]。

圖7 北蟲(chóng)草培養(yǎng)液中可溶性蛋白和游離氨基酸含量的變化Fig.7 Change of soluble protein and free amino nitrogen content in the medium of Cordyceps militaris

3 結(jié)論

研究了北蟲(chóng)草菌絲體液態(tài)深層發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵液的主要營(yíng)養(yǎng)成分、pH及菌絲體代謝物質(zhì)的變化情況。pH、可溶性固形物含量、總糖和還原糖在發(fā)酵過(guò)程均總體呈下降趨勢(shì)；游離氨基酸含量先變化遲緩而后上升；菌絲體產(chǎn)量、蟲(chóng)草素含量呈先增加后下降趨勢(shì)；胞外粗多糖含量略有下降；可溶性蛋白含量先下降后上升。

[1]Masuda M，Urabe E，Sakurai A，et al.Production of cordycepin by surface culture using the medicinal mushroom Cordyceps militaris[J].Enzyme and Microbial Technology，2006，39：641-646.

[2]張平，朱述鈞，錢(qián)大順，等.北冬蟲(chóng)夏草功能成分及保健作用分析[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2003（6）：105-107.

[3]金田，石俊英.近五年北蟲(chóng)草藥理作用研究進(jìn)展[J].食品與藥品，2011，13（9）：358-360.

[4]杜秀菊，張勁松，蔡連捷，等.北蟲(chóng)草體外抗病毒、抗腫瘤活性部位的篩選[J].食品科學(xué)，2011，32（17）：313-316.

[5]李義勇，陳玉嬋，李冬利，等.幾種蟲(chóng)草菌發(fā)酵提取物的抗菌抗腫瘤活性研究[J].食品工業(yè)科技，2010，31（6）：88-90，93.

[6]李曉磊，趙珺，高長(zhǎng)城，等.蟲(chóng)草醇提物的抗氧化活性及保健酒的研制[J].食品工業(yè)科技，2010，31（6）：229-231.

[7]吳雪晶，馬慧君，劉寧.北蟲(chóng)草與冬蟲(chóng)夏草的藥用價(jià)值比較[J].浙江食用菌，2009，5（8）：12-14.

[8]胡亞平.功能性食藥用菌蛹蟲(chóng)草的開(kāi)發(fā)技術(shù)研究[D].長(zhǎng)沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004：3-6.

[9]Shih IL，Tsai KL，Hsieh C.Effects of culture conditions on the mycelial growth and bioactive solid metabolite production in submerged culture of Cordyceps militaris[J].Biochemical Engineering Journal，2007，33：193-201.

[10]解春艷，顧振新，顧穎娟，等.北蟲(chóng)草液態(tài)發(fā)酵天然培養(yǎng)基的優(yōu)化研究[J].食品工業(yè)科技，2012，33（4）：223-226

[11]Mao XB，Eksriwong T，Chauvatcharin S，et al.Optimization of carbon source and carbon-nitrogen ratio for cordycepin production by submerged cultivation of medicinal mushroom Cordyceps militaris[J].Process Biochemistry，2005，40：1667-1672.

[12]Mao XB，Zhong JJ.Significant effect of NH4+on cordycepin production by submerged cultivation of medicinal mushroom Cordyceps militaris[J].Enzyme Microbiology Technology，2006，38：343-350.

[13]陳志杰，顧振新，解春艷.靈芝發(fā)酵過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及相關(guān)酶活性變化研究[J].中國(guó)釀造，2008，178（1）：26-29.

[14]諸葛健，李華鐘.微生物學(xué)[M].北京：科學(xué)出版社，2004：236-238.

[15]Shih IL，Tsai KL，Hsieh CY.Effects of culture conditions on the mycelial growth and bioactive metabolite production in submerged culture ofCordyceps militaris[J].Biochemical Engineering Journal，2007，33：193-201.

[16]Hattori M，Isomura S，Yokoyama E，et al.Extracellular Trypsin-like proteases produced by Cordyceps militaris[J].Journal of Bioscience and Bioengineering，2005，100：631-636.

Study on changes of nutriments and metabolites during fermentation of Cordyceps militaris

XIE Chun-yan1，LING Wei1，GU Ying-juan2，GU Zhen-xin2，*
（1.Life Science Institute，Langfang Nnormal College，Langfang 065000，China；2.Key Laboratory of Agricultural and Animal Products Processing and Quality Control，Ministry of Agriculture，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China）

TS201.2

A

1002-0306（2012）16-0179-04

2011-12-06 *通訊聯(lián)系人

解春艷（1983-），女，博士，副教授，研究方向：食品新資源的應(yīng)用與功能性食品開(kāi)發(fā)。

廊坊市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2011012001）；廊坊師范學(xué)院博士基金項(xiàng)目（LSZB201003）。