云蔗03-194甘蔗組培快繁技術(shù)

吳轉(zhuǎn)娣，劉家勇，楊 昆，趙 俊，趙培方，吳才文，張 敏，姚 麗

（云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所/云南省甘蔗遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，開遠(yuǎn) 616600）

甘蔗糖業(yè)是云南邊疆民族地區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展、蔗農(nóng)脫貧致富的支柱產(chǎn)業(yè)。云南省蔗糖產(chǎn)業(yè)已經(jīng)成為我省僅次于“兩煙”的第二大生物資源產(chǎn)業(yè)，同時(shí)云南也是我國第二大糖料生產(chǎn)基地。選育和推廣甘蔗新品種是提高我國甘蔗產(chǎn)量、降低蔗糖生產(chǎn)成本的重要手段[1－2]。目前，我國甘蔗旱坡地栽種面積已占植蔗面積的80%以上，迫切需要推廣種植強(qiáng)宿根抗旱甘蔗新品種，以提高我國甘蔗單產(chǎn)，保證蔗糖產(chǎn)業(yè)的穩(wěn)定可持續(xù)發(fā)展。2011年云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所通過國家甘蔗品種鑒定，推出了云蔗03-194甘蔗新品種，其母本為新臺糖25，父本為粵糖97-20，該品種從預(yù)備品比階段就開始進(jìn)行宿根性研究，田間綜合表現(xiàn)為中大莖，葉片清秀，蔗莖均勻整齊，株形好，抗倒伏,脫葉好，宿根性強(qiáng)等優(yōu)良性狀。于2009—2010年推薦參加國家第七輪區(qū)域試驗(yàn)和生產(chǎn)試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果：云蔗03-194中早熟、高產(chǎn)高糖，抗旱性強(qiáng)，經(jīng)受住了2009年云南百年不遇的特大干旱的考驗(yàn)，在2009—2011年云南持續(xù)特大干旱中表現(xiàn)突出，產(chǎn)量高、糖分高，抗倒伏和脫葉性好，被蔗農(nóng)稱為“兩刀”甘蔗，收獲時(shí)在蔗蔸和梢頭砍兩刀就可作為原料甘蔗交糖廠；經(jīng)人工鑒定對黑穗病的抗性級別為1級，抗性反應(yīng)型為抗?。蝗斯っ{迫抗旱性強(qiáng)。自然條件下未發(fā)現(xiàn)花葉病、梢腐病和黃葉綜合癥等病害。2010年底廣西柳城遭遇強(qiáng)烈低溫凍害過程中表現(xiàn)出了很強(qiáng)的抗寒性和宿根性。適合在云南、廣西、廣東、福建等蔗區(qū)肥力中等以上的蔗區(qū)種植，在燥熱蔗區(qū)種植優(yōu)勢更為明顯，具有很好的推廣應(yīng)用價(jià)值。本研究對云蔗03-194甘蔗品種進(jìn)行組培快繁研究，旨在加快該甘蔗品種在全國推廣應(yīng)用的速度，為該品種健康種苗的生產(chǎn)提供技術(shù)基礎(chǔ)[3]。

1 材料與方法

1.1 材料

以云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所內(nèi)種植的甘蔗品種云蔗03-194為試驗(yàn)材料，取甘蔗莖頂部約60cm長，帶回實(shí)驗(yàn)室后剝?nèi)ゲ糠掷先~梢，即獲得外植體。

1.2 外植體的處理和愈傷誘導(dǎo)

取甘蔗外植體，用75%酒精輕輕噴洗表面，放入超凈工作臺中，剝?nèi)ネ馊~梢至見到甘蔗幼嫩葉片，置于滅菌紙上切成1mm薄片，接種于盛有培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，每皿培養(yǎng)基上接種10片，用保鮮膜包邊，置于暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 15～20d，溫度 28±2℃。 培養(yǎng)基配方為 MS+2,4-D 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mg/L。觀察記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.3 分化誘導(dǎo)與增殖培養(yǎng)

將生長良好的愈傷組織隨機(jī)接種于分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，分化培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，為6-BA和KT 不同濃度的組合，共 12 個(gè)組合，即 MS+6-BA 1.0、2.0、3.0mg/L+KT 0.25、0.50、0.75、1.0 mg/L，每個(gè)組合中接種10瓶，每瓶接種10個(gè)。光照培養(yǎng)20～25d，光照14h，光照度為1500～2000lx，溫度28±2℃。觀察并記錄芽分化的情況。

將分化培養(yǎng)獲得的小苗轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基中，增殖培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，6-BA和KT不同濃度的組合，共 12 個(gè)組合，即 MS+6-BA 1.0、2.0、3.0mg/L+KT 0.50、0.75、1.0、1.25mg/L。將分化出來的甘蔗苗切小2～3株一叢，每個(gè)組合中接種10皿，每皿接種3～5叢。光照培養(yǎng)20～25d換1次培養(yǎng)基，增殖培養(yǎng)5次，光照14h，光照度為1500～2000lx，溫度28±2℃。觀察并記錄芽分化的情況。

1.4 生根培養(yǎng)

增殖獲得的甘蔗小苗轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中，生根培養(yǎng)基也是以MS為基本培養(yǎng)基，NAA和香蕉汁不同濃度組合，即 MS+NAA 0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L+10、20、30、40mL/L 香蕉汁。 將一叢叢的甘蔗小苗切成單株，每個(gè)組合中接種10瓶，每瓶接種10株。光照培養(yǎng)20～25d，光照14h，光照度為1500～2000lx，溫度28±2℃。觀察并記錄芽分化的情況。

在甘蔗愈傷的誘導(dǎo)、分化培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)的培養(yǎng)基中均加入3%蔗糖、0.4%瓊脂，pH值為5.8。

1.5 甘蔗組培苗煉苗、假植及定植

組培苗生根后，將高6～10cm生根良好的小苗整瓶置于2500～3000lx自然散射光下煉苗4d，使其適應(yīng)自然環(huán)境后打開瓶蓋煉苗3d。將小苗假植于4種不同的移栽基質(zhì)中，即河沙，紅壤土，河沙：紅壤土（2∶1），河沙∶紅壤土（1∶2）待成活后出圃定植，小苗移植30d后觀察結(jié)果。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 外植體的處理及愈傷生長情況

在晴天或雨后4h從田間取回甘蔗莖，外植體經(jīng)75%酒精噴洗后，不需要用升汞消毒，直接剝?nèi)ネ馊~梢就可獲得無菌的甘蔗葉片外植體，污染率在1%～5%。如果出現(xiàn)污染，將其中部分好的愈傷換到新的培養(yǎng)基中，與升汞消毒相比操作方便，污染的機(jī)率也少，不會出現(xiàn)大量污染的情況。

2，4-D濃度對甘蔗愈傷的生長影響很大，當(dāng)濃度較低時(shí)，愈傷的生長增重較慢，質(zhì)地也比較硬；當(dāng)濃度較高時(shí)，愈傷的長勢好，但是愈傷的質(zhì)量較差，活性不好，難以分化，甚至分化后出現(xiàn)變異。由表1可以看出3號培養(yǎng)基中的愈傷組織長勢好，而且質(zhì)量最好。因此，最適宜云蔗03-194甘蔗愈傷生長的培養(yǎng)基為MS+2,4-D 1.5mg/L。

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2.2 愈傷分化誘導(dǎo)與增殖培養(yǎng)情況分析

根據(jù)表2的數(shù)據(jù)，可以看出云蔗03-194甘蔗愈傷在MS+6-BA 1.0mg/L+KT 0.50 mg/L的培養(yǎng)基中芽分化誘導(dǎo)率最高，6-BA和KT兩者濃度較低時(shí)芽的分化速度較慢且生長較弱，而濃度較高時(shí)芽的分化受到抑制生長也細(xì)弱，葉片發(fā)黃。只有在兩者濃度都比較適宜的時(shí)候才會長勢好芽粗壯，葉色深綠。

分化培養(yǎng)基與增殖培養(yǎng)基相似，但是實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析表明：從愈傷分化小苗的階段需要的6-BA和KT的濃度較增殖培養(yǎng)基的要低一些。從表3中可知，最適宜云蔗03-194甘蔗小苗增殖的培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg/L+KT 1.0 mg/L。在該培養(yǎng)基中增殖獲得的甘蔗小苗長勢好，葉深綠，苗粗壯。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明：在分化培養(yǎng)時(shí)用低濃度培養(yǎng)基 （6-BA 1.0mg/L+KT 0.50 mg/L）在增殖培養(yǎng)時(shí)用高濃度培養(yǎng)基 （6-BA 2.0 mg/L+KT 1.0 mg/L），組培獲得的云蔗03-194甘蔗小苗變異少，苗的長勢好、苗粗壯。

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2.3 不同NAA濃度和香蕉汁添加量對甘蔗小苗生根的影響

從表4可以看出，培養(yǎng)基中不同NAA的濃度和香蕉汁添加量都能夠啟動云蔗03-194甘蔗的生根，生根率全部達(dá)到100%。但是，NAA始終是影響生根的重要因素，NAA的濃度對根的生長速度影響較大，當(dāng)NAA的濃度在1.5 mg/L時(shí)根的誘導(dǎo)最快，根長。香蕉汁的作用主要是提供植株生長的營養(yǎng)物質(zhì)，對生根沒有誘導(dǎo)作用，當(dāng)香蕉汁的添加量達(dá)到30mL/L時(shí)，可以很好地促進(jìn)根長粗，使甘蔗植株生長健壯。因此，最適宜的生根培養(yǎng)基為MS+NAA 1.5 mg/L+30mL/L香蕉汁。

2.4 不同基質(zhì)對組培苗假植成活率的影響

從表5可看出，云蔗03-194甘蔗在4種不同基質(zhì)中小苗的成活率都較好，其中以沙∶紅壤土（2∶1）的效果最好，成活率達(dá)到92%～96%，植株生長健壯，長勢最好。

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3 結(jié)論與討論

甘蔗的組織培養(yǎng)有一定的特性，不同品種之間存在一定的差異，特別是在愈傷誘導(dǎo)方面，有些品種需要較高的2，4-D濃度，而有些品種愈傷在較低濃度時(shí)生長良好。在一些高要求的實(shí)驗(yàn)如甘蔗的轉(zhuǎn)基因研究中部分甘蔗品種的愈傷誘導(dǎo)很難達(dá)到要求，因?yàn)樵诘蜐舛葧r(shí)愈傷生長慢，長勢不好，質(zhì)量不夠好，而濃度高時(shí)，愈傷的生長過快，活性不好，變異率高。因此，愈傷誘導(dǎo)時(shí)2，4-D的濃度一定要控制好。通過進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)我們證實(shí)云蔗03-194甘蔗在2，4-D濃度為1.5 mg/L時(shí)，生長最適宜。當(dāng)外植體接種后出現(xiàn)嚴(yán)重褐化現(xiàn)象時(shí)，是因?yàn)楦收嶂械亩喾宇愇镔|(zhì)較高而引起的，這與品種有關(guān)。云蔗03-194甘蔗沒有出現(xiàn)嚴(yán)重褐化的情況，因此不需要添加PVP，只需要加少量的活性碳就可以了。

有報(bào)道在甘蔗的誘導(dǎo)分化和增殖培養(yǎng)中使NAA與6-BA組合使用[4]，但實(shí)驗(yàn)表明，云蔗03-194在6-BA與KT組合使用時(shí)效果最好，增殖快，變異少，苗粗壯。在壯苗實(shí)驗(yàn)中香蕉汁和椰子汁都可取得良好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。目前，云蔗03-194甘蔗品種組培苗已移栽大田并已經(jīng)在推廣應(yīng)用。

[1]陳躍.云南甘蔗產(chǎn)業(yè)發(fā)展情況[A].云南省第十二次甘蔗學(xué)術(shù)交流會論文集[C].2006:1-8.

[2]李奇?zhèn)?，陳子云，梁?現(xiàn)代甘蔗改良技術(shù)[M].廣州：華南理工大學(xué)出版社，2000：65.

[3]劉麗敏，李松，戴友銘，余坤興，劉紅堅(jiān)，淡明.甘蔗莖尖脫毒培養(yǎng)技術(shù)研究[J].中國糖料，2009（2）：18-20.

[4]何洪良，唐君海，藍(lán)慶江，等.甘蔗新品系桂糖02-901的離體快繁技術(shù)[J].農(nóng)業(yè)研究與應(yīng)用，2011，133（2）：62-63.