響應(yīng)曲面法優(yōu)化蓮房原花青素提取工藝研究

陳衛(wèi)航，譚美亭，張 婕

(鄭州大學(xué)化工與能源學(xué)院，河南鄭州450001)

原花青素(Procyanidins，簡稱PC)是一類多酚化合物的總稱，由不同數(shù)量的兒茶素或表兒茶素縮合而成［1］.原花青素是目前國際上公認(rèn)的清除人體內(nèi)自由基最有效的天然抗氧化劑之一，其抗氧化能力是維生素E的50倍以上，是維生素C的20倍以上［2］.蓮房為蓮科藥用植物蓮的成熟花托，含有豐富的原花青素(Procyanidins of Lotus Seed Pot，簡稱LSPC)，含量達(dá)7.8%［3］，在蓮加工過程中，大量的蓮房被丟棄，資源未被充分利用.從蓮房中提取PC實(shí)際上屬于廢棄物利用，研究蓮房原花青素的提取工藝不僅具有很大的科學(xué)價(jià)值，還會(huì)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)效益.目前，關(guān)于蓮房PC的研究還處于起步階段，主要在藥理作用方面［4-5］.據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，蓮房中原花青素的提取方法有微波輔助丙酮提取法［6］、脈沖超聲輔助丙酮提取法［7］和雙酶輔助乙醇提取法［8］，但關(guān)于單一乙醇提取法提取蓮房中原花青素并采用響應(yīng)面法優(yōu)化工藝條件的研究鮮見報(bào)道.筆者以廢棄物蓮房為原料，采用乙醇作為提取劑提取，并利用響應(yīng)面分析法［9］優(yōu)化蓮房中原花青素的最佳提取工藝參數(shù)，以期為蓮房原花青素的工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

干燥蓮房：購于河北安國市中藥材市場;

試劑：原花青素標(biāo)準(zhǔn)品(四川維克奇生物有限公司)、香草醛、甲醇、乙醇、濃鹽酸，均為分析純;儀器：RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)、AB204-N電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)、UV-1810S紫外分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)、THZ-82數(shù)顯水浴恒溫振蕩器(江蘇城西曉陽電子儀器廠).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線測定

采用香草醛—濃鹽酸顯色法［10］：精確稱取原花青素標(biāo)準(zhǔn)品配制成1.0 mg/mL對照品標(biāo)準(zhǔn)溶液，再配制成40～200 μg/mL濃度對照品標(biāo)準(zhǔn)系列.在10 mL反應(yīng)瓶中依次加入20 g/L香草醛溶液2.5 mL、濃鹽酸2.5 mL，冷卻后加入原花青素標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL，混合均勻后在20℃下避光顯色反應(yīng)20 min.以香草醛/甲醇、濃鹽酸和甲醇的體積比為2.5∶2.5∶1.0混合溶液作為空白對照，在500 nm處測吸光度.以吸光度為縱坐標(biāo)，蓮房原花青素濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=0.004 24x-0.022 86，R2=0.999 97.

1.2.2 蓮房原花青素的提取

稱取脫脂蓮房2.00 g，按一定料液比加入乙醇水溶液，在設(shè)定溫度下恒溫?cái)嚢杞嵋欢〞r(shí)間后，抽濾，保存濾液，將濾渣重復(fù)提取，提取2次，合并濾液，定容稀釋后測定蓮房原花青素濃度，并計(jì)算原花青素提取量.

1.2.3 原花青素含量的測定

原花青素含量測定采用香草醛-濃鹽酸顯色法［10］.蓮房原花青素(LSPC)提取量 Y=VCn100/(1 000×W).式中：Y為每100 g蓮房中得到蓮房原花青素量，mg/100 g;V為提取液體積，mL;C為提取液中蓮房原花青素濃度，mg/mL;n為提取液稀釋倍數(shù);W為蓮房重量，g.

1.2.4 單因素和響應(yīng)曲面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取溫度、提取時(shí)間為影響因素，考察其對蓮房原花青素提取量的影響.根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)4因素3水平的響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn).為考察方便，提取次數(shù)均為1次，試驗(yàn)均設(shè)3次重復(fù)，取平均值.

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

選定實(shí)驗(yàn)條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%，溫度為50℃，時(shí)間為2 h，液料比為20 mL/g.在保持其中3個(gè)因素固定的條件下，變化另一個(gè)因素，分別研究乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取溫度、提取時(shí)間的變化對蓮房原花青素提取量的影響，結(jié)果如圖1所示.由圖1可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取溫度、提取時(shí)間的增加，原花青素提取量也相應(yīng)增加，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%，液料比為20 mL/g，提取溫度為55℃，提取時(shí)間為50 min時(shí)，蓮房原花青素有最大提取量.故取乙醇體積分?jǐn)?shù)40%～60%、液料比15～25 mL/g、提取溫度45～65℃、提取時(shí)間為40～60 min范圍內(nèi)進(jìn)行響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn).

2.2 響應(yīng)曲面法設(shè)計(jì)方案與試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取溫度和提取時(shí)間4個(gè)因素為自變量，分別用X1、X2、X3、X4表示，以蓮房原花青素提取量為響應(yīng)值Y，并以1、0、-1分別代表自變量的高、中、低水平，因素編碼及各自變量水平見表1，試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2.

圖1 (a)乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響(溫度50℃，時(shí)間2 h，液料比20 mL/g)

圖1 單因素對LSPC提取量的影響Fig.1 Effects of factors on LSPC extraction yield

表1 響應(yīng)曲面分析因素與編碼水平Tab.1 Factors and levels of response surface methodology

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)共29個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，其中1～24為析因點(diǎn)，25～29為零點(diǎn)，析因點(diǎn)在變量取值為X1、X2、X3、X4所構(gòu)成的三維頂點(diǎn) ，零點(diǎn)為區(qū)域的中心點(diǎn)，其中零點(diǎn)實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，用以估算實(shí)驗(yàn)誤差.

2.3 二元回歸方程擬合和方差分析

利用Design Expert7.1.6軟件對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到蓮房原花青素提取量預(yù)測值對編碼自變量的二次多項(xiàng)回歸方程：

表2 響應(yīng)曲面法優(yōu)化LSPC提取工藝分析方案與試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 The experimental design and results of response surface methodology on LSPC extraction technology

模型的可靠性可從方差分析(表3)及相關(guān)系數(shù)來考察.結(jié)果表明，模型是極顯著的 (P＜0.01)，回歸模型的決定系數(shù)為0.967 9，說明回歸方程可以很好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系.因此，可利用此回歸方程確定蓮房原花青素最佳提取工藝條件.

回歸方程中各變量對響應(yīng)值影響的顯著性，由F檢驗(yàn)法判定，概率 P的值越小，則相應(yīng)變量的顯著性程度越高.從表3可以看出，一次項(xiàng)X2、X3是極顯著(P ＜0.01)，X4是顯著(P ＜ 0.05)，二次項(xiàng) X1X2、X2X3是顯著，X2X4是極顯著是極顯著，是顯著，其余項(xiàng)均不顯著.因此，各具體試驗(yàn)因子對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系.從 F值可以看出，單因素對原花青素提取量的影響順序依次是提取溫度 ＞液料比＞提取時(shí)間＞乙醇體積分?jǐn)?shù).

表3 響應(yīng)面法優(yōu)化LSPC提取工藝方差分析結(jié)果Tab.3 The results of ANOVA on LSPC extraction technology

2.4 交互作用分析

圖2是根據(jù)回歸方程所繪制出各因素交互作用的響應(yīng)面圖，其投影面為等高線圖.對比可知，提取溫度對蓮房原花青素提取量的影響最為顯著，表現(xiàn)為圖2(b)、2(d)、2(f)的曲面較為陡峭，這說明要獲得良好的提取效果，在提取過程中對提取溫度的控制至關(guān)重要.由圖2(e)可以直觀地反映出液料比與提取時(shí)間之間交互作用相當(dāng)顯著，表現(xiàn)為該圖等高線的橢圓形狀最為顯著，而乙醇體積分?jǐn)?shù)與料液比、液料比與提取溫度之間交互作用也是顯著的.這些結(jié)果都與回歸方程的方差分析相吻合，說明響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)能夠較好地反映出試驗(yàn)所設(shè)定的四個(gè)因素對蓮房原花青素提取量的影響.

2.5 最優(yōu)工藝條件及驗(yàn)證試驗(yàn)

利用Design Expert7.1.6軟件根據(jù)所建立的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行參數(shù)最佳化分析，得到最優(yōu)提取工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%，液料比25 mL/g，提取溫度55℃，提取時(shí)間60 min，提取1次，進(jìn)行4次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，測得蓮房原花青素提取量為6.678 mg/100 g，與理論預(yù)測值6.693 mg/100 g接近.因此，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化得到的工藝可行，參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值.

3 結(jié)論

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，對蓮房原花青素提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，建立蓮房原花青素提取量的二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型，模型具有顯著性，模型決定系數(shù)為0.967 9.由Design Expert7.1.6軟件對數(shù)學(xué)模型進(jìn)行參數(shù)最優(yōu)化分析并結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，得到蓮房原花青素提取的最佳工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%、液料比25 mL/g、提取溫度55℃、提取時(shí)間60 min，提取1次，實(shí)際提取產(chǎn)量為6.678 mg/100 g，與理論預(yù)測值6.693 mg/100 g接近.本研究為工業(yè)化利用豐富的蓮房資源提取原花青素提供了依據(jù).

［1］高羽，董志.原花青素的藥理學(xué)研究現(xiàn)狀［J］.中國中藥雜志，2009，34(6)：651-655.

［2］BAGCHI D，GARG A，KROHN RL，et al.Oxygen free radical scavenging abilities of vitamins C and E and a grape seed proanthocyanidin extract in vitro［J］.Res Commun Mol Pathol Pharmacol，1997，95(2)：179-189.

［3］凌智群.蓮房原花青素及其生物、藥理活性研究［D］.武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)系，2001.

［4］GONG Yu-shi，LIU Lie-gang ，XIE Bi-jun，et al.A-meliorative effects of lotus seedpod proanthocyanidins on cognitive deficits and oxidative damage in senescence-accelerated mice［J］.Behavioural Brain Research，2008，194(1)：100-107.

［5］DUAN Yu-qing，ZHANG Hai-hui，XU Fei-fei，et al.Inhibition effect of procyanidins from lotus seedpod on mouse B16 melanoma in vivo and in vitro［J］.Food Chemistry，2010，122(1)：84-91.

［6］段玉清，閆永勝，張海暉，等.蓮房多酚的微波輔助提取技術(shù)［J］.江蘇大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，30(9)：437-440.

［7］段玉清，張海暉，李金鳳，等.脈沖超聲輔助提取蓮房多酚的工藝［J］.農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2009，25(1)：193-197.

［8］汪志慧，孫智達(dá)，謝筆鈞，等.響應(yīng)曲面法優(yōu)化雙酶法提取蓮房原花青素［J］.食品科學(xué)，2010，32(4)：64-68.

［9］楊文雄.響應(yīng)面方法及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用［J］.中國食品添加劑，2005(2)：68-71.

［10］鄭俊霞，肖付才，李華.香草醛-HPLC結(jié)合法測定葡萄籽超微粉中的原花青素［J］.食品科技，2009，34(11)：304-308.